豬圓環病毒2型貴州株ORF1基因的生物信息學分析

楊利勇，李春鳳，周繼勇

（1.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州310058；2.貴州福斯特生物科技有限公司，貴州 貴陽550014）

豬圓環病毒（Porcine cirvovirus，PCV）屬圓環病毒科圓環病毒屬，被國際病毒分類委員會（ICTV）第6次學術報告列為一個新的病毒。PCV 最早在PK－15 細胞中發現，開始認為是一種細胞污染物[1－2]。PCV分為2個主要的基因型，即PCV1 與PCV2型，其中PCV2被認定是導致仔豬斷奶后多系統衰竭征（PMWS）的主要病原[3]。PCV2常與細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬肺炎支原體 （MPS）、偽狂犬病毒（PRV）混合感染，造成豬的免疫失敗[4－5]。PCV2基因組有11個開放性閱讀框，其中ORF1是PCV2基因組中最大的閱讀框，編碼病毒復制相關蛋白（Rep）[6]，Rep蛋白能被原核表達系統所表達[7]，為在蛋白水平上研究Rep 蛋白提供了良好的工具。將體外表達的ORF1編碼蛋白與表達粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子的真核表達質粒聯合免疫豬群，能起到抵抗PCV2攻擊的作用，表明針對ORF1基因編碼蛋白的抗體可能具有中和病毒的作用[8]。鑒于此，筆者針對PCV2ORF1基因序列設計1對特異性引物，以PCV2陽性病料所提DNA 為目標，獲取PCV2貴州株（PCV2－GZ）ORF1基因，并分析其生物信息學特性，旨在為后續的疫苗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料及試劑

PCV2貴州株（PCV2－GZ）陽性病料，由貴州大學動物疫病研究所保存。DNAiso Reagent提取試劑盒，pMD18－T 載體，dNTPs，200bp DNA Marker，Amp，購自大連寶生物有限公司；Gel Extraction Kit（50×）膠回收試劑，E.Z.N.ATMPlasmid Mini Kit質粒提取試劑盒，購自OMEGA 公司；Taq酶，購自北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶（BamH Ⅰ、HindⅢ），購自MBI公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 引物的設計與合成

參考GenBank 登錄PCV2 代表性毒株ORF1基因序列，以Prime 5.0軟件設計針對ORF1基因的 特 異 性 引 物， P－F： 5′－ATGCCCAGCAAGAAGAATG－3′， P－R：5′－TCAGTAATTTATTTCATATGGAA－3′，大小945bp，由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.3 目的基因的獲取、克隆及序列測定

PCV2－GZ陽性病料無菌研磨處理后，按DNA提取試劑盒說明書提取病料總DNA，以總DNA 為模板，用引物P－F／P－R 進行PCR 擴增。反應體系：引物（10pmoL／μL）各2μL，10×PCR Buffer（含MgCl2）5μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，Taq 酶（5U／μL）1μL，滅菌雙蒸水補足50.0μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35 個循環；72℃延伸10 min。取擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒純化回收目的基因。按常規T 載體克隆方法進行重組質粒構建及PCR；將擴增片段克隆到pMD18－T中，所得重組質粒以EcoRⅠ／HindⅢ進行雙酶切鑒定；將初步鑒定為陽性的重組質粒進行測序。

1.4 PCV2ORF1 生物信息學分析

用DNAStar軟件對PCV2－GZ 與國內外毒株（表）進行ORF1 基因核苷酸、氨基酸同源性分析，并分別分析其編碼蛋白的α－螺旋、β－折疊、T－轉角、無規則卷曲及親水性、表面可及性和抗原指數，對蛋白二級結構和B 細胞抗原表位進行預測，用Karplus－Schulz方法預測其柔性區域；用MegAlign軟件繪制系統進化樹，比較分離株親緣關系；用InterProScan軟件分析蛋白結構域；用SWISS－Model軟件預測蛋白的三維空間結構。

表 PCV2 ORF1核苷酸序列的登錄信息Table The genbank accession information of different PCV2strains

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增

從 圖1 可 知，PCV2－GZ 陽 性 病 料 經PCV2ORF1特異性引物擴增出945bp的特異性條帶，與預期擴增片段大小相符。

圖1 PCV2 ORF1基因的PCR 擴增電泳圖譜Fig.1 PCR results of ORF1PCV2

2.2 重組質粒酶切鑒定

經雙酶切鑒定，電泳檢測到961bp和2 692bp的2條譜帶（圖2），酶切結果與預期相符，初步證明所克隆的目的基因成功插入pMD18－T 載體，可進行后續基因序列測定。

圖2 重組質粒的雙酶切結果Fig.2 The double digestion of restructuring plasmid

2.3 PCV2－GZ ORF1基因序列

經測序，PCV2－GZORF1基因全長945bp，編碼Rep蛋白共314個氨基酸（圖3）。測序結果登陸GeneBank，獲取登錄號為KF152883。

2.4 ORF1基因的同源性

經同源性分析，PCV2－GZORF1基因與其他14株毒株的核苷酸同源性為96.8%～99.7%，與國內HUB－5和ZJ－38的同源性最高，均為99.7%。推導的氨基酸序列同源性，PCV2－GZ編碼的Rep蛋白與韓國P710－1和國內HUB－5、SC－10、ZJ－38株的較高，均為99.4%。

2.5 系統進化樹

從圖4可知，PCV2－GZORF1基因與國內毒株相應序列同屬于一個分支，而與國外毒株（韓國P710－1株）的親緣關系相距較遠。

圖3 PCV2－GZORF1 基因的序列Fig.3 The sequeces of the PCV2－GZ ORF1gene strain

圖4 PCV2 ORF1基因的核苷酸系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ORF1gene nucleotide

圖5 PCV2－GZ Rep蛋白的二級結構Fig.5 Secondary structure prediction of PCV2－GZ Rep protein

2.6 Rep蛋白的二級結構及抗原表位

經預測，Rep蛋白柔性區域呈散在性分布，以β－折疊、T－轉角和無規則卷曲為主（圖5）。可能的抗原表 位區為N 端第2～18 位、23～34 位、86～98位、159～167位、189～205位、287～297位（圖6），推測PCV2－GZ Rep蛋白可形成優勢抗原表位。

圖6 PCV2－GZ Rep蛋白的抗原表位Fig.6 Epitope prediction of PCV2－GZ Rep protein

圖7 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的結構域Fig.7 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

圖8 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的三維結構Fig.8 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

2.7 蛋白結構域及蛋白三維結構

從圖7 可知，PCV2－GZ Rep 蛋白第171～257位氨基酸處存在解旋酶；在N 端15～100位氨基酸處存在病毒復制相關蛋白；在111～285位氨基酸處存在P－loop，是dNTP 結合的位點，具有潛在的ATP水解酶功能，且不存在跨膜結構和信號肽。

經預測，PCV2－GZORF1基因Rep蛋白含有β－折疊和T－轉角（圖8）。

3 結論與討論

Rep蛋白由PCV 最大的開放閱讀框ORF1編碼，ORF1 基因由病毒的正向鏈轉錄而成，與PCV基因組滾環復制相關[9]。Rep蛋白和Rep’蛋白是PCV 病毒復制所必需。PCV1Rep基因的啟動子位于728～838位核苷酸區域[10]。Rep 蛋白具有與典型滾環復制（RCR）相關的3個保守結構，分別為Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及結合dNTPs的P環（P－loop）結構（序列為G－GKS），對維持Rep蛋白的功能至關重要，缺失或突變均會影響病毒的復制[11]。PCV2Rep基因位于第51～995位核苷酸，含有945個堿基，編碼315個氨基酸，編碼病毒復制相關蛋白。PCV1與PCV2相比，氨基酸序列同源性達86%，但Rep 蛋白相對比較保守，2種血清型PCV 病毒有抗原交叉。曾朔等[12]研究表明，圓環病毒Rep基因可能是原核生物解旋酶編碼基因間的重組產物。

研究結果表明，PCV2－GZORF1 基因全長為945bp，編碼314個氨基酸，與國內外流行毒株的同源性（98.1%～99.4%）較高。核苷酸序列與國內毒株的同源性較高，可能是由于近年來貴州畜牧業的快速發展，大量跨區引種，豬群流動性增加所致[13]。Rep蛋白是PCV 病毒在復制早期利用宿主細胞的蛋白合成系統，由自身基因組上的ORF1 轉錄、翻譯及加工而成，主要功能是在截短蛋白Rep’的協同作用下，啟動和終止病毒DNA 滾環式復制[14]。Rep蛋白不存在于病毒粒子中，在體外培養細胞（如PK－15）中含量也較少，要獲取足量的一定純度的天然Rep蛋白變得極為困難，一般采用體外表達來獲取該蛋白[15]。利用軟件對PCV2－GZORF1 基 因Rep蛋白結構預測表明，Rep蛋白可形成優勢抗原表位，且不存在跨膜結構和信號肽，推測可進行PCV2ORF1基因的全基因表達[16]。

[1]Gillespie J，Opriessnig T，Meng X J，et al.Porcine circovirus type 2and porcine circovirus－associated disease[J].Vet.Intern.Med.，2009，23（6）：1151－1163.

[2]Harding J C S，Ellis J A，McIntosh K A，et al.Dual heterologous porcine circovirus genogroup 2a／2binfection induces severe disease in germfree pigs[J].Vet Microbiol，2010，145（3－4）：209－219.

[3]王先煒，姜 平，李玉峰，等.華東地區PMWS患病豬群PCV－2的檢測及其基因特征[J].中國獸醫學報，2004，24（3）：240－242.

[4]王憲文，姚四新，王麗榮，等.豬圓環病毒Ⅱ型流行病學新特點及致病機理研究進展[J].中國畜牧獸醫，2012，39（12）：190－194.

[5]Laila Darwich，Enric Mateu.Immunology of porcine circovirus type 2（PCV2）[J].Virus Res，2012，164（1－2）：61－67.

[6]Benjamin R Trible，Raymond Rowland.Genetic variation of porcine circovirus type 2（PCV2）and its relevance to vaccination，pathogenesis and diagnosis[J].Virus Res，2012，164（1－2）：68－77.

[7]Finsterbusch.Interaction of the replication proteins and capsid protein of porcine circovirus type 1and 2 with host proteins[J].Virology，2009，386（1）：122－131.

[8]劉 丹，王一平，吳洪麗，等.豬圓環病毒2 型Rep／Rep＇和Cap蛋白亞單位疫苗免疫保護性試驗[J].中國預防獸醫學報，2013，35（11）：916－919.

[9]王亞丹，盧權威，陳紅英，等.豬圓環病毒2型河南株全基因組的克隆與序列分析[J].中國獸醫學報，2012，32（10）：1429－1434.

[10]李 杰，葛 猛，羅 維，等.豬圓環病毒2型Rep蛋白ELISA 抗體檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2012，11（34）：894－897.

[11]Guo L J，Lu Y H，Wei Y W，et al.Porcine circovirus type 2（PCV2）：genetic variation and newly emerging genotypes in China[J].Virol，2010（7）：273.

[12]曾 朔，吳星星，冉多良，等.豬圓環病毒Ⅱ型ORF1基因的克隆與原核表達[J].新疆農業大學學報，2011，34（4）：307－310.

[13]崔亞蘭，王開功，張 華，等.2007—2011年貴州省豬圓環病毒感染的流行病學調查[J].畜牧與獸醫，2013，45（3）：70－73.

[14]Andrew K C.Porcine circovirus：Transcription and DNA replication[J].Virus Res，2012，164（1－2）：46－53.

[15]Cino－Ozuna，Henry S，Hesse R，et al.Characterization of a new disease syndrome associated with porcine circovirus type 2 （PCV2）in previously vaccinated herds[J].Clin Microbiol，2011，49（5）：2012－2016.

[16]Nathan M B，Meng X J.Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus type 2 （PCV2）[J].Virus Research，2012，164（1－2）：33－42.