大腸桿菌對環丙沙星和恩諾沙星的敏感性恢復

曾祥煉，譚艾娟＊，呂世明，曹正花，常 鑫，劉日昂

（1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽550025）

隨著抗菌藥物的廣泛應用，尤其是不規范使用[1]，導致耐藥菌增多、耐藥性水平增高、耐藥譜擴大及耐藥機制的復雜化[2]，使耐藥菌感染疾病的病程延長，甚至治療失效。因此，細菌耐藥性已成為威脅人類健康的重大因素之一[3]。如何延緩或降低細菌耐藥性的產生與發展，恢復其對藥物的敏感性已成為目前全球研究的熱點。我國和其他國家或組織，如歐盟主要是通過促進合理使用抗生素、預防感染、開發新型抗生素和耐藥性監測等措施控制耐藥性的問題，但實施效果不理想[4]。環丙沙星和恩諾沙星是獸醫臨床上最常用的2種治療細菌性感染的藥物，因而其耐藥性問題非常嚴重。為給制定臨床使用抗菌藥物的輪換用藥方案，降低耐藥性的危害提供科學依據，筆者研究了耐藥細菌對同類抗菌藥物敏感性恢復的差異以及細菌傳代、營養因素和耐藥菌比例對敏感性恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、藥品和培養基

菌株：耐藥大腸桿菌D600、野生型大腸桿菌D549（敏感菌株），由貴州大學動物科學學院基礎獸醫實驗室提供；質控菌株為大腸埃希氏菌標準菌株ATCC25922，購自中國獸藥監察所。藥品：環丙沙星、恩諾沙星標準品，購于上海盛思生化科技有限公司。培養基：LB肉湯、米勒－海頓肉湯（MHB），購于上海博微生物科技有限公司。

1.2 藥物的最小抑菌濃度（MIC）測定

參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗操作標準，采用微量肉湯稀釋法，測定試驗菌株對環丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.3 不同傳代耐藥菌的敏感性測定

將大腸桿菌耐藥菌株D600劃線于麥康凱平板上，挑取1個單菌落接種于LB 肉湯中，37℃恒溫培養18h，3次重復，然后按1%（體積分數）轉接到新LB肉湯中，以此作為0代菌株，以后每天傳1次，連續傳代至32d（細菌生長代數參照細菌傳代方法[5]計算，24h內約為6.64代，共計約210代），每隔30代測定對環丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.4 不同耐藥菌比例下耐藥菌的敏感性測定

將含相同菌落數的D600 和D549 按0.05∶0.95、0.1∶0.9、0.15∶0.85、0.2∶0.8、0.5∶0.5、1∶0體積比例混合，在無營養匱乏脅迫因子（正常營養）條件下培養，按不同傳代耐藥菌對藥品的敏感性測定方法設置重復與傳代，每隔30代測定對環丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.5 不同營養水平下耐藥菌的敏感性測定

將菌株D600 分別接種于用生理鹽水稀釋2倍、4倍、8倍、16倍和32倍后的LB肉湯中，按不同傳代耐藥菌對藥品的敏感性測定方法設置重復與傳代，每隔30代測定對環丙沙星和恩諾沙星的MIC值。

1.6 多因子綜合作用下耐藥菌的敏感性測定

采用L9（33）正交試驗設計，選擇傳代次數、耐藥菌比例和營養因子等3個因素（表1），按不同傳代耐藥菌對藥品的敏感性測定方法設置重復與傳代，并測定其對環丙沙星和恩諾沙星的MIC 值，篩選出耐藥菌敏感性恢復的最佳條件。

表1 多因子對耐藥菌敏感性恢復的L9（33）正交試驗設計Table 1 The L9（33）orthogonal design of multiple factors to drug－sensitivity restoration

2 結果與分析

2.1 藥物的最小抑菌濃度

從表2看出，大腸桿菌ATCC25922 和大腸桿菌D549均為敏感菌株，大腸桿菌D600對環丙沙星和恩諾沙星均高度耐藥。

表2 環丙沙星和恩諾沙星對試驗菌株的MIC 值Table 2 The MIC value of tested strains to ciprofloxacin and enrofloxacin

表3 不同傳代次數耐藥菌D600的MIC值Table 3 MIC values of D600with different subcultivation times

2.2 不同傳代耐藥菌D600的敏感性

從表3看出，經210代傳代，環丙沙星對耐藥大腸桿菌D600的MIC 值從0代的128μg／mL 下降至210代的32μg／mL，而對恩諾沙星的敏感性沒有變化。經線性回歸分析，耐藥菌傳代次數與環丙沙星MIC值間呈顯著關系（P＜0.05），與恩諾沙星MIC值間差異不顯著。說明，耐藥大腸桿菌D600對環丙沙星的敏感性可隨傳代而逐步恢復。

2.3 不同耐藥菌比例下耐藥菌D600的敏感性

從表4看出，耐藥菌比例變化對細菌敏感性恢復的影響均較小，環丙沙星對細菌的MIC 值由0代的128μg／mL 下降至60～210代的16μg／mL，而對恩諾沙星的MIC值沒有變化。說明，在沒有營養匱乏脅迫因子作用下，野生型敏感菌不能形成優勢菌群，對菌群敏感性恢復沒有作用。

2.4 不同營養水平下耐藥菌D600的敏感性

從表5看出，隨著傳代次數的增加和營養水平的下降，耐藥菌對2 種藥物的敏感性均逐漸恢復，對環丙沙星、恩諾沙星的 MIC 值由0 代的≥128μg／mL（高度耐藥）分別恢復到210 代的0.25μg／mL和1.0μg／mL（敏感）。

2.5 多因子綜合作用下耐藥菌D600的敏感性

從表6看出，3個因素對耐藥菌D600恢復環丙沙星、恩諾沙星的敏感性均有作用，培養基稀釋倍數越大、耐藥菌比例越小、傳代次數越多則細菌對2種藥物的MIC值越小，直至恢復到敏感。對降低環丙沙星MIC值的貢獻率大小依次為培養基稀釋倍數（R＝0.916 3）、耐藥菌比例（R＝1.083 3）、傳代次數（R＝1.75）；對降低恩諾沙星MIC 值的貢獻率大小依次 為 耐 藥 菌 比 例 （R＝1.583 4）、傳 代 次 數（R＝3.417）、培養基稀釋倍數（R＝3.75）。說明，在具有營養匱乏脅迫因子作用下，野生型敏感菌易形成優勢菌群，對菌群敏感性的恢復有較大作用。

表4 不同耐藥菌比例下耐藥菌D600的MIC值Table 4 MIC values of D600with various proportion of drug－resistant strains μg／mL

表5 不同營養水平下耐藥菌D600的MIC值Table 5 MIC values of D600with various nutrition levels μg／mL

表6 多因子綜合作用下耐藥菌D600的MIC 值Table 6 MIC values of D600with the influences of multiple factors

3 結論與討論

細菌耐藥性伴隨著抗菌藥物的應用而出現[6]。不同類別抗菌藥物耐藥性的產生機制以及停用后敏感性恢復的快慢不同，同類抗菌藥物耐藥性的產生機制以及停用后敏感性恢復的快慢相似[7]，與本研究結果不符，即氟喹諾酮類藥物中環丙沙星的敏感性恢復速度快于恩諾沙星，且存在較大差異，可能是2種藥物在耐藥形成的分子機制上存在差異。高度耐藥大腸桿菌D600在沒有恩諾沙星的選擇壓力下其耐藥水平相當穩定，其MIC值歷經210代傳代沒有變化。與孟甄等的研究，即高水平耐藥性的表型并非遺傳穩定的，去除選擇壓力以后易于恢復的結論[8]不一致。

在無藥物選擇壓力下，大腸桿菌D600 自然傳代210代，對環丙沙星的敏感性可逐漸恢復；敏感菌與耐藥菌不同比例混合對敏感性恢復作用不明顯；營養匱乏的脅迫作用在細菌的敏感性恢復中發揮重要作用，敏感菌與耐藥菌比例因子只有在營養匱乏脅迫條件下才能發揮作用，可能是營養匱乏有利于基因的篩選，促進野生型敏感菌形成優勢菌群而降低藥品的MIC值。

本研究僅用2種藥物對細菌的敏感性恢復進行研究，建議今后對細菌的敏感性恢復進行系統研究，以評估各種因子，尤其是臨床抗菌藥物使用環境相關因子在細菌藥物敏感性恢復中的作用，并制定抗菌藥物重復用藥的條件與標準，為防止耐藥性的產生及降低細菌耐藥性的危害提供依據[9]；篩選出敏感性恢復較好的藥物，結合本地細菌耐藥性檢測結果為人醫臨床以及獸醫臨床制定合理的輪換用藥方案[10]，即多使用敏感性易于恢復的藥物，少使用或盡量不用敏感性難恢復的抗菌藥物，以達到降低細菌耐藥性的目的。

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