丁香酚對鯉魚腦和脊髓中鈉鉀泵活性的抑制效果

孫文淵，呂世明＊，譚艾娟，林艷紅，安 苗，華 夏，李博巖，焦亞琴

（1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽550025）

鈉鉀泵簡稱鈉泵，也稱Na＋－K＋－ATP酶，是一種鑲嵌在膜脂質雙層中具有ATP 酶活性的蛋白質，廣泛分布于各類細胞質膜上，在中樞神經系統，Na＋－K＋－ATP酶具有較高的生物活性。有研究表明，Na＋－K＋－ATP酶可能具有信號轉導的作用[1－2]。丁香酚是一種有機化合物，主要用于抗菌、降血壓等，且對多種水生動物有較好的麻醉作用[3]，其麻醉時間長、蘇醒快，藥物殘留量少，對人和魚均安全，但對其全麻作用的確切部位及分子機制仍不清楚，影響其在動物醫學領域的深度開發和廣泛應用。因此，為探明Na＋－K＋－ATP 酶是否為丁香酚作用的靶位之一，研究了鯉魚在丁香酚麻醉下各腦區Na＋－K＋－ATP酶的變化，以期為了解丁香酚的作用機制和進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：丁香酚（Xiya Reagent），吐溫80（Solar－bio），司班80（Xiya Reagent），無水乙醇（天津市武清區大良鎮工業園），ATP酶試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

儀器：722 分光光度計（上海欣茂儀器有限公司），高速低溫離心機（德國Eppendor）。

1.2 丁香酚乳劑的配制

參照呂世明等[3]的方法配制，即吐溫80∶司班80∶無水乙醇∶丁香酚＝4∶2∶1∶2。

1.3 動物分組與處理

取體重900～1 000g、體長40～45cm 的鯉魚40尾，先喂養7d以適應環境，水溫20～22℃，試驗前停食1d，隨機分為對照組（10尾）、丁香酚處理組（30尾）。對照組：將鯉魚放入不含丁香酚乳劑水溶液中藥浴10min后取出，采集腦組織和脊髓，在生理鹽水冰面上迅速分取大腦、中腦、小腦、間腦、延腦和脊髓，立即液氮冷凍保存備用。丁香酚處理組：將鯉魚放置于含40mg／L丁香酚乳劑的水溶液中藥浴，分別采集處于誘導期、麻醉期和麻醉恢復期的各10尾鯉魚腦組織和脊髓，按對照組方法處理，液氮冷凍保存備用。魚麻醉分期標準參照李思發[4]的方法執行。

1.4 Na＋－K＋－ATP酶活性測定

參照南京建成生物工程研究所提供的ATP 酶活力測定方法制備樣品勻漿，考馬斯亮蘭法測腦組織的蛋白濃度，分光光度法測Na＋－K＋－ATP 酶活力，酶活力單位以每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分 解ATP 產 生1 μmol 無 機 磷 的 量 表 示，即μmol／（mg·h）。

1.5 統計分析

試驗數據以均數± 標準差表示，采用SPSS 17.0數據統計分析軟件進行LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性

從表1看出，對照組鯉魚各腦組織中Na＋－K＋－ATP酶活性不同，以脊髓中最高，為（8.12±0.70）μmol／（mg·h）；小腦最低，為（4.87±0.05）μmol／（mg·h）。經丁香酚藥浴后鯉魚各腦和脊髓中的Na＋－K＋－ATP酶活性均不同程度下降，抑制作用隨麻醉程度加深而加強，在麻醉期時抑制作用最強。與對照組相比，各腦和脊髓在麻醉期的Na＋－K＋－ATP酶活性均極顯著下降；誘導期的大腦、間腦和脊髓的Na＋－K＋－ATP 酶活性均極顯著下降，小腦的酶活性顯著下降，中腦和延腦的酶活性下降但差異不顯著。與麻醉期相比，恢復期除間腦和延腦外，其余各腦組織中Na＋－K＋－ATP酶活性均呈極顯著升高，但仍低于對照組。

表1 試驗鯉魚不同腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶的活性Table 1 Activity of Na＋ －K＋ －ATPase in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

2.2 不同腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP 酶活性的抑制率

從表2看出，在誘導期，丁香酚對大腦和脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率大，分別達33.7%和37.6%；中腦和延腦的較小，分別為10.0%和12.4%。在麻醉期，丁香酚對脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最大，達53.9%；對大腦、中腦、小腦和間腦的酶活性抑制率較接近，為32.5%～37.6%；對延 腦 的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最小，為23.8%。在恢復期，各腦組織中Na＋－K＋－ATP 酶活性抑制率又降低，其中小腦中的降幅最大，其次是延腦和脊髓，大腦和間腦中的降幅較小。

表2 試驗鯉魚不同腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制率Table 2 Inhibition rate of Na＋－K＋－ATPase activity in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

3 結論與討論

Na＋－K＋－ATP酶主要分布于機體具有分泌性和興奮性的組織中，神經系統中含量尤為豐富。Na＋－K＋－ATP酶可通過改變細胞構象實現離子轉運，產生并維持細胞膜電位，對維持神經細胞的興奮產生和傳導具有重要作用，并對神經遞質的釋放和信息傳遞也具有重要意義[5－6]。 另外，Na＋－K＋－ATP 酶也可借助Na＋／Ca2＋交換間接調節胞內Ca2＋濃度以調控神經遞質的釋放，影響神經細胞及神經細胞與肌肉或腺體細胞之間的信息傳遞[7－8]。所以，麻醉藥影響Na＋－K＋－ATP 酶活性必將對神經元的電興奮活動和信息傳遞產生影響。麻醉藥對中樞神經系統Na＋通道、Na＋／Ca2＋交換及Na＋－K＋－ATP酶有抑制作用，通過擾亂Na＋，K＋，Ca2＋離子的穩定發揮其麻醉作用[9－11]。

研究結果表明，丁香酚可降低鯉魚各腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性，隨麻醉程度的增加（從誘導期到麻醉期）抑制逐漸增強；酶活性抑制程度的變化與鯉魚被丁香酚麻醉后出現的觸覺喪失，魚體平躺，直至靜止水中的行為學變化相平行；從麻醉期到恢復期，丁香酚對各腦區和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制逐漸減輕，酶活性逐漸恢復，與之平行的行為學變化表現出鯉魚觸覺恢復，游動越來越平穩靈活。表明，丁香酚對鯉魚的麻醉作用與其抑制腦Na＋－K＋－ATP酶活性有關，即Na＋－K＋－ATP酶可能是丁香酚全麻作用的靶位之一。

全麻藥的分子機制是一個非常復雜的過程，涉及跨膜細胞信號轉導、細胞內信息轉導和離子通道等方面的諸多內容[12－13]。目前，未見國內外有關丁香酚麻醉魚類的分子機制研究報道。本研究結果在細胞跨膜信號轉導方面揭示了丁香酚的全麻作用機制，其確切分子機制還有待進一步全面深入研究。

[1]文玉杰，李曉玫.鈉鉀ATP酶的信號轉導功能新進展[J].生理科學進展，2005，36（2）：59－162.

[2]Gang W，Kiyoshi K，Gregory G.Divergent signaling pathways mediate induction of Na＋，K＋－ATPaseα1 anβ1subunit gene transcription by low potassium[J].Molecular and cellular biochemistry，2007，294（4）：73－85.

[3]呂世明，蔡洪能，譚艾娟，等.丁香酚乳液和醇溶液對鯉魚麻醉作用的對比研究[J].天津農業科學，2009，15（3）：1－3.

[4]李思發.魚類麻醉劑[J].淡水漁業，1988（1）：22－23.

[5]Schuurmans－Stekhoven F，Bonting S L.Transport adenosine triphosphatases：Properties andfunction[J].Physiological Reviews，1981，61（1）：1－76.

[6]Oashi T，Uchida S，Nagai K，et al.Studies on phosphate hydrolyzing activities in the synapticmembrane[J].The Journal of Biochemistry，1970，67（5）：635－641.

[7]成同怡，吳本階.Na＋，K＋－ATP的結構和功能[J].國外醫藥：分子生物學分冊，1990，12（5）：236－238.

[8]Stojanoric T，Mrsulja B R.Alteration in synaptosmal membrane，Na＋，K＋－ATPase of the gerbilcortex and hippocampus following reversible brain ischemia[J].Metabolic Brain Disease，1988，13（4）：256－310.

[9]Lysko P G，Webb C L，Yue T L，et al.Neuro protective effects of tetrodotoxin as a Na＋channel modulator and glutamate release inhibit or in culture rat cerebral neurons and in geroil brain ischemia[J].Stroke，1994，25（12）：2476－2482.

[10]Rehberg B，Xia Y H，Duch D S.Central nervous system sodium channel are significantly suppressed at clinical con cent rations of volatile anesthetics[J].A nest hesiology，1996，84（6）：1223－1233.

[11]Kulkarni R S，Rehberg B，Jean－Louis H，et al.Inhibitory effects of ketamine and halothane on recombinant potassium channels from mammalian brain[J].Anesthesiology，996，84（6）：900－99.

[12]范宏剛，盧德章，王洪斌，等.替來他明及小型豬復方麻醉劑（XFM）對大鼠不同腦區一氧化氮和一氧化氮合酶的動態影響[J].中國獸醫雜志，2008，44（10）：12－15.

[13]王洪斌，范宏剛，胡 魁，等.噻環乙胺對大鼠不同腦區NOS 活性及NO 產量和cGMP含量的影響[J].畜牧獸醫學報，2008，38（11）：1599－1605.