中藥艾總DNA的提取及ISSR－PCR反應體系的優化

王惠君，王文泉，盧 誠，王海燕，陳 新

（1.瓊州學院，海南 三亞572022；2.中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海南 ?？?71101）

中藥艾葉[1]為菊科植物艾（ArtemisiaargyiLevl et Vant）的干燥葉片。艾葉又稱作蘄艾、艾蒿、醫草、灸草等。其功效早在戰國的醫書《黃帝內經》中有記載。2000多年前，艾葉作為正式藥物記載在陶弘景的《名醫別錄》中，從此艾葉在中醫臨床上得到廣泛應用。艾葉的入藥成分主要是春、夏的葉片，葉片最好在花未開放、葉片較茂盛時采摘并陰干或曬干較好。中醫在長期臨床實踐中總結艾葉性溫、辛、味苦，具有固脫回陽、溫補益、散結消瘀、行氣活血、驅逐寒濕、溫經通絡、安胎和止血等功效。艾資源在全球分布較廣泛，采收方便，因而艾具有較高的開發和利用價值。但艾在各地的質量性狀參差不齊，目前仍未滿足大規模的開發和利用，因此對于發掘優良艾的種質資源用于大規模人工種植栽培品種尤為迫切。從艾的研究進展看，雖在艾葉的有效成分提取分 離[2－5]、鑒定分析技術[6]和藥理性研究[7－8]方面均取得一定成果，但對于艾資源的各地品種質量性狀的多樣性研究仍是空白。

運用現代分子標記技術分析種質材料的親緣關系和遺傳多樣性可提高艾育種效率。常見的分子標記技術有SSR、RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SRAP、SNP等，通常用于品種鑒定、植物遺傳多樣性、遺傳作圖等方面的研究。其中，ISSR（inter－simple sequence repeat）又稱為簡單重復序列區間，是由加拿大Zietkiewicz 等[9]提出，通過利用錨定的SSRDNA 作為引物進行PCR 反應擴增，進而檢測相鄰SSR 之間基因組DNA 序列的差異。與其他分子標記技術相比，ISSR 分子標記不僅信息量大、精確度高，而且多態性高、穩定性好、操作簡單、便于檢測，尤其可在不同的物種間通用，該技術已廣泛應用在農作物、花卉、樹木、中藥材等方面，迄今未見任何分子生物學技術用于艾種質資源研究的報道。由于ISSR 分子標記技術是在PCR 擴增反應基礎上開發，因而其反應條件也易受眾多因素的干擾，如引物、模板DNA、Mg2＋、dNTPs、Taq酶等濃度均直接影響ISSR－PCR 擴增。因此，為確保ISSR－PCR 擴增結果的穩定和準確，需對此擴增反應體系進行優化。筆者在提取艾基因組DNA 以及單因素試驗的基礎上進行L16（45）正交試驗，用以優化艾葉反應體系，旨在為艾葉藥材分子鑒定、遺傳多樣性研究以及優良品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 中藥艾、試劑與儀器

1.1.1 艾 采自湖北蘄春艾的葉片，采摘后迅速裝入自封袋中置于冰盒，于實驗室－70℃超低溫冰箱中保存備用。

1.1.2 試劑 CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、EDTA（乙二胺四乙酸）、EB（溴化乙錠）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、Buffer緩沖液、MgCl2、DL2000（DNA 分 子 標 記）、dNTPs、Taq酶（大連寶生物公司）、ISSR 隨機引物（參照哥倫比亞大學UBC公布的第9套ISSR 引物序列、其序列由上海生物工程有限公司合成）、DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器 恒溫水浴鍋、GILSON 移液槍、超凈工作臺、電子天平、高速冷凍離心機、PCR 擴增儀（Bio－Rad，T1000）、梯 度PCR 儀（Eppendorf）、Gel Doc EQ 凝膠成像系統（Bio－Rad，Chemi Doc XRS）、電泳儀和電泳槽（北京六一廠DYY－10C）、紫外分光光度計（ES－2）。

1.2 艾基因組DNA的提取與檢測

艾基因組DNA 的提取分別采用3種方法。即改良CTAB方法[10]、SDS法[11]和試劑盒法。

為保證基因組DNA 提取質量，用試劑盒提取的艾基因組DNA 作對比。將提取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠（加入EB 濃度為0.5μg／mL）電泳及核酸檢測儀檢測其純度和濃度，并將提取得到的DNA 樣品稀釋至約50ng，－20℃保存備用。

1.3 PCR反應體系單因素最優設計

選用純度高的DNA 模板同時參考Zietkiewicz E[9]和劉本英[12]的反應條件進行引物初篩，初設定ISSR－PCR 反 應 體 系 確 定 為 （20μL）：模 板DNA 25ng，Mg2＋2.5mmol／L，dNTPs 0.25mmol／L，引物0.6μmol／L，10×PCR Buffer緩沖液2.0μL，Taq DNA 聚合酶1.75U。

反應的程序預設定：94℃預變性5min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，35個循環，72℃最后延伸8 min，產物在4℃保存。首選重復性好、擴增譜帶清晰的引物用于后續優化試驗。依據表1中各個因素水平分別探究各因素對ISSR擴增反應體系的影響，最后獲得單因素最優處理。

表1 PCR 反應體系各因素試驗水平設計Table 1 Factors and levels of PCR reaction

1.4 PCR反應體系正交試驗的最優設計

選用正交設計L16（45）分別在4個不同水平上試驗（表2）。在PCR 儀上進行擴增反應，擴增產物選用1.6%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后將膠體放入凝膠成像系統中觀察并拍照保存。試驗結果參照何正文等[13]的方法分析，對ISSR－PCR 擴增結果依據譜帶的強弱和多少進行直觀分析評分，分值為1～16。即將16個處理中譜帶數量最多且清晰度最高，同時背景最干凈的記為最高分值16，與此相反，最差的記最低分值1，最后獲得艾ISSR－PCR 擴增反應各因素的最優處理。參照穆立薔等[14]方法，根據分值求出各因素在同一水平上的試驗值之和Ki以及各因素水平上的數據平均值ki，并求出同一因素在不同水平之間平均值的方差SS和極差R。將單因素試驗結果與正交試驗結果進行綜合分析，最后獲得艾ISSR－PCR 擴增的優化反應體系。

表2 PCR 反應的因素水平L16（45）正交試驗設計Table 2 L16（45）orthogonal design for the factors and levels of PCR reaction

1.5 退火溫度的確定

依據試驗結果，將優化的反應體系在梯度PCR模式下設定退火溫度為48～54℃，依據產物結果數據確定最優的退火溫度。

2 結果與分析

2.1 艾基因組DNA的提取

圖1 3種方法提取基因組DNA的電泳圖片Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by three methods

由圖1可見，試劑盒提取的艾基因組DNA，電泳譜帶明亮清晰，上樣孔干凈，無拖尾現象，亦無蛋白質和RNA 雜質的譜帶，經過紫外分光光度計測定OD260和OD280，其OD260／OD280值為1.82，濃度為50～70ng／μL，試劑盒提取的DNA 純度和質量均較高；用改良CTAB 法所提取的DNA 樣品清晰明亮，亦無雜質譜帶，OD260／OD280值為1.85，濃度為20～50ng／μL，質量相對較高，可滿足試驗的質量要求；用SDS法提取的DNA 樣品明亮，但存在明顯拖尾，OD260／OD280值為1.92，表明樣品有RNA 污染。從經濟方面考慮，選用改良CTAB 法提取艾基因組DNA。

2.2 ISSR－PCR擴增的反應條件優選

從圖2看出，不同因素影響下ISSR－PCR 擴增反應體系的變化情況。結果表明：

1）Mg2＋濃度。當Mg2＋濃度為1.5 mmol／L時，ISSR 擴增出的譜帶比較弱；而濃度為2.0～2.5mmol／L時，均能擴增出比較清晰的譜帶；當Mg2＋濃度為3.0mmol／L時，擴增出的譜帶特異性減弱。故宜選取2.0mmol／L 和2.5mmol／L 為Mg2＋的最佳濃度。

2）引物濃度。隨著體系中的引物濃度增加，擴增的譜帶也逐漸增強。在濃度達1.0μmol／L 時，譜帶的清晰度開始下降，故確定0.6～0.8μmol／L作為引物的最佳濃度。

3）dNTPs 濃度。泳道1、泳道2 可能由于dNTPs濃度比較低，擴增出的譜帶條紋少。當濃度在0.20mmol／L以上時得到的譜帶清晰穩定，故確定0.20mmol／L作為dNTPs的最佳濃度。

4）模板DNA。經電泳分離檢測結果顯示，各濃度存在差異，當模板DNA 的量小于30ng時，擴增的譜帶較為模糊；當模板DNA 的量達到120ng時，擴增條帶清晰明亮，開始出現拖尾現象；當模板DNA 的量為60～90ng 時，擴增譜帶比較清晰明亮，譜帶的數量和亮度的強弱基本一致。表明，艾ISSR 反應對模板DNA 的濃度要求為60～90ng。為節約模板DNA 故設定模板DNA 的濃度為60ng。

5）Taq酶的含量。4 個Taq酶用量處理均可得到譜帶相同的擴增結果，當酶的用量為0.5U 和1.0 U 時擴增出的譜帶稍弱；當Taq 酶用量為1.5～2.0U可獲得良好的擴增結果。從降低試驗成本且保證質量的角度考慮，試驗選擇Taq酶的用量為1.0U。

圖2 不同因素條件下ISSR－PCR 反應體系的變化Fig.2 ISSR－PCR reaction system variation of different influencing factors

圖3 ISSR－PCR的擴增圖譜Fig.3 Result of orthogonal design PCR products

2.3 ISSR－PCR擴增的評分及最優選擇

由圖3可見，ISSR－PCR 的擴增條帶的強弱，直觀分析評分得到1～16條帶的分值分別為1 分、7分、10分、5分、6分、11分、15分、5分、5分、14分、16分、10分、10分、11分、14分和6分。

由表3可知，對艾葉ISSR－PCR 反應影響最大的是Mg2＋濃度，而Taq酶濃度的影響最小。此外，利用ki值還可估計各因素的最佳水平，當ki值越大，則該水平最佳。因此，其中各因素的最佳水平為Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，模板DNA 60 ng，Taq酶2.0 U。由于dNTPs的最大Ki值為2個，對 應 的 濃 度 分 別 為 0.15 mmol／L和0.25mmol／L，從成本考慮選擇0.15 mmol／L，考慮Taq酶濃度對此反應的影響最小。這一組合在正交表中并未出現，但與分值最高的11號處理接近，僅是模板DNA 量不同。考慮到節約成本，Taq酶濃度應選1.0U。

表3 ISSR－PCR 擴增的正交設計直觀分析Table 3 Intuitive analysis of orthogonal design of ISSR－PCR amplification

圖4 最佳體系的ISSR－PCR驗證圖譜Fig.4 The best system of ISSR－PCR

2.4 正交試驗與單因素分析的比較及其驗證

依據單因素分析最優體系（1）為模板DNA 60 ng，Mg2＋2.0 mmol／L，引 物0.6 μmol／L，dNTP 0.2mmol／L，Taq酶1.0U。依據正交試驗直觀圖得最優化體系及為處理11的體系（2）為模板DNA 30 ng，Mg2＋2.5 mmol／L，引 物0.8 μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶2.0U。依據正交分析結果 分 析 得 體 系 （3）為 模 板DNA 60 ng，Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶1.0U。

對以上3個體系驗證結果（圖4）表明，3個處理的譜帶相差較小，1處理譜帶清晰度相對弱，2處理與3處理幾乎沒有差別。從成本考慮，選擇3處理為艾葉最佳的ISSR－PCR 反應體系。

2.5 PCR退火溫度的選擇

圖5 引物UBC811退火溫度不同的擴增圖譜Fig.5 Results of annealing temperature on ISSR－PCR amplification of UBC811

由圖5 顯示，溫度低時則特異性較差，泳道1～5，譜帶相對較多同時缺失小片段；退火溫度較高時引物與模板的結合性差，又造成大片段的缺失，泳道9～12，導致PCR 擴增產物譜帶數減少2 條，同時亮度減弱。因此，UBC811的最佳退火溫度范圍介于第6與第8的溫度之間，因而選定為54℃。

3 結論與討論

影響艾ISSR－PCR 擴增反應效果的主要因素包括模板DNA、Mg2＋、引物濃度、dNTPs、Taq酶及退火溫度設定等。Mg2＋濃度對ISSR－PCR 擴增反應起關鍵作用。其作為Taq 酶的輔助因子之一，Mg2＋濃度不但對Taq酶的活性有影響，而且還可與反應液中的模板DNA、dNTPs及引物相結合，影響模板DNA 與引物的結合效率，影響模板DNA 與PCR 產物的解鏈溫度，影響擴增產物的特異性，影響引物二聚體的形成。引物濃度對PCR 擴增產物的帶型產生較為明顯的影響，如濃度較高產生非特異條帶，濃度較低將不能擴增。dNTPs 作為ISSR－PCR擴增反應的原料，其濃度較低將影響合成的效率，甚至因過早的被消耗而使產物單鏈化，直接影響擴增效果；其濃度較高又將導致PCR 錯配率增加，從而使擴增反應出現較多的非特異性擴增。ISSR擴增反應體系中模板DNA 的純度和含量對擴增產物的特異性及獲得率有直接影響。若模板含量較低，分子之間碰撞的機率也較低，PCR 擴增產物也不穩定，甚者不能擴增出產物；若模板含量較高，相應增加非特異性產物的擴增。若模板DNA 的純度不高，多糖或RNA 等其他雜質阻礙擴增反應，使擴增反應不穩定，增加非特異性產物的擴增。在ISSR－PCR 擴增反應中，Taq酶是PCR 擴增的重要影響因素之一。Taq酶用量過少將使酶過早地被消耗而降低產物合成反應效率；過多會產生較多的非特異性擴增譜帶使試驗結果失真，同時還增加試驗成本。ISSR－PCR 擴增反應中，退火溫度的高低也直接影響到模板DNA 與引物的特異性結合。一般情況下，較低的退火溫度可保證模板與引物結合的穩定性，同時盡可能選擇較高的退火溫度，這樣可減少模板DNA 與引物之間的非特異性結合；對于不同的引物和不同基因組DNA 退火最適溫度也不同。用以上最優體系分別對不同引物進行梯度退火試驗，在梯度PCR 儀上設置溫度范圍，將PCR 擴增產物分別進行電泳分離檢測。綜合以上2種方法結果，最終獲得適合艾的ISSR－PCR 最優反應體系。

試驗結果表明，在正交試驗中發現Mg2＋濃度對此反應體系的影響較大，這與王彥華[15]、劉曉靜[16]和吳生[17]等研究結果相符。在單因素試驗中除Taq酶和模板DNA 外，其余3 個因素對ISSRPCR 反應體系均有影響。2種方法得各因素的最佳優化體系也不盡相同。總之，5種主要因素對反應體系的影響既獨立又互補。單因素試驗可直觀地顯現出各主要因素對反應體系的相對影響，但不能顯現各因素間的交互作用，利用正交設計可較快地獲得最優體系，但對于結果的主觀性較強，因而缺乏可靠性。在不同的試驗條件下，如不同的試驗儀器、試驗試劑、試驗材料以及操作人員與實驗室環境條件等，均對擴增結果產生影響[18]，當建立和優化PCR反應體系時建議綜合采用上述2種方法。試驗結果還顯示，對艾ISSR－PCR 的影響依次為Mg2＋濃度＞引物＞模板DNA＞dNTPs濃度＞Taq酶，即艾的ISSR－PCR 分析的最佳擴增體系條件為模板DNA 60ng，Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶1.0U。經反復試驗，在此優化條件下擴增反應結果穩定性強且重復性好。該反應體系為ISSR 標記技術開展艾的遺傳圖譜構建及其遺傳多樣性分析奠定基礎。

[1]梅全喜.艾葉的研究與應用[M].北京：中國醫藥科技出版社，2013.10.

[2]川吉雙，張予川，刁云鵬，等.艾葉的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2009，26（8）：617－619.

[3]唐生安，孫 亮，翟慧媛，等.艾葉化學成分的研究[J].天津醫科大學學報，2011，17（4）：461－463.

[4]孫 鋒，張寬朝.野生艾草黃酮的含量及抗氧化性研究[J].中國野生植物資源，2009，28（3）：58－61.

[5]江 丹，易 筠，楊 梅，等.不同產地艾葉總黃酮含量比較[J].中南民族大學學報，2009，28（1）：55－56.

[6]徐新建，宋 海，韓玉琦，等.艾葉揮發油化學成分的氣相色譜－質譜聯用分析[J].時珍國醫國藥，2007，18（11）：2657－2658.

[7]胡林峰，崔乘幸，吳玉博，等.艾蒿化學成分及其生物活性研究進展[J].河南科技學院學報，2010，38（4）：75－78.

[8]陳小露，梅全喜.艾葉化學成分研究進展[J].藥學進展，2013，23（12）：848－851.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genmoe fingerinting by simple se－quence repeats（SSR）－anhored polymerease chain reaction amplification[J].Gen－moics，1994，20：176－183.

[10]劉曉靜，王海燕，張根良，等.改良CTAB法提取益智基因組DNA[J].江西農業學報，2007，19（8）：111－112.

[11]王景雪，孫 毅，高武軍.一種簡便實用的植物總DNA 提取方法[J].山西大學學報：自然科學版，2000，23（3）：271－272.

[12]劉本英，李友勇，唐一春，等.云南茶樹資源遺傳多樣性與親緣關系的ISSR 分析[J].作物學報，2010，36（3）：391－400.

[13]何正文，劉運生，陳立華，等.正交設計直觀分析法優化PCR 條件[J].湖南醫科 大學學報，1998，23（4）：403－404.

[14]穆立薔，劉贏男，馮富娟，等.紫椴ISSR－PCR 反應體系的建立與優化[J].林業科學，2006，42（6）：25－31.

[15]王彥華，侯喜林，徐明宇.正交設計優化不結球白菜ISSR 反應體系研究[J].西北植物學報，2004，24（5）：899－902.

[16]Liu X J，Wang W Q.Establishment and Optimization of ISSR－PCR Reaction System For Alpinia oxyphylla[J].Miq.Biotechnology，2008，28（3）：33－37.

[17]Wu S，Xiong Y T，Xie Y，et al.Optimization for ISSR－PCR reaction system on Schisandra henryi by orthogonal design[J].Chin Tradit Herb Drugs（中草藥），2011，42（5）：976－979.

[18]代紅艷，張志宏，周傳生，等.山楂ISSR 分析體系的建立和優化[J].果樹學報，2007，24（3）：313－318.