清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠腫瘤壞死因子α及核轉錄因子κB表達的影響

曹吳冰 高連印 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠腫瘤壞死因子α及核轉錄因子κB表達的影響

曹吳冰 高連印 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

目的 觀察清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠內毒素(endotoxin,ET)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)表達的影響,探討該方治療慢性重型肝炎內毒素血癥的作用機制。方法 建立硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)致實驗性大鼠重癥肝損傷模型,給予清毒湯干預后,檢測大鼠ET、TNF-α以及NF-κB表達的水平。結果 與正常組比較,模型組大鼠血清ET、TNF-α以及NF-κB蛋白含量水平均顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,清毒湯中、低劑量組和乳果糖組ET、TNF-α以及NF-κB蛋白含量水平顯著降低(P＜0.01),清毒湯高劑量組除ET外各指標均明顯改善(P＜0.05);與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組ET及TNF-α水平顯著降低(P＜0.01),低劑量組ET及TNF-α水平無明顯差異(P＞0.05),高劑量組ET及TNF-α水平明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。結論 清毒湯對實驗性肝損傷大鼠模型具有降低ET、TNF-α以及NF-κB蛋白水平的作用,尤其中劑量組效果最為明顯,推測其分子機制可能為通過抑制NF-κB因子的表達從而達到保肝目的。

內毒素系由腸道革蘭陰性菌死亡而產生的,由門靜脈入肝,大量的內毒素入肝可引起已損傷的肝細胞過度炎性反應,加重肝細胞損傷。臨床發現,慢性重型肝炎合并腸源性內毒素血癥的病死率約為50～90%[1]。本研究擬建立硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)致實驗性大鼠重癥肝損傷模型,予王融冰教授經驗方清毒湯進行干預,通過觀察清毒湯對模型大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及核轉錄因子 κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)表達的影響,進一步研究清毒湯通過抑制NF-κB及TNF-α活性以保護肝臟的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠48只,雌雄各半,體質量為180～200 g,動物許可證號:SCXK(京)2012-0001,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,飼養于首都醫科大學動物實驗科學部SPF級動物室,實驗期間,各組大鼠均自由攝食、飲水,喂普通飼料。

1.2 藥物

清毒湯藥物組成:大黃10 g、枳實10 g、厚樸10 g、生地黃12 g、茜草9 g,上述藥物均購自北京同仁堂,由首都醫科大學動物室煎制,制備成生藥含量1.5 g/mL的水煎劑,4℃冰箱保存備用。乳果糖購自北京科奧科技有限公司,批號:ka0009454;TAA購自北京科奧科技有限公司,批號:S0646。

1.3 主要試劑和儀器

內毒素試劑盒(南京建成生物工程研究所), TNF-α(eBioscience,CA,USA),NF-κB p65抗體(ab131485,abcam)。包埋機(Leica EG1160,德國),切片機(H93/RM2126,德國),OLYMPUS BX-41熒光顯微鏡(日本),NIKON DIGITAL SIGHT彩色CCD (日本),Image Pro Plus 6.0 Media Cybernetics公司),Multiskan MK3酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司),高速冷凍離心機(XIANGYI)。

1.4 造模分組及給藥

48只大鼠適應性喂養1周后,隨機選取8只作為正常組,給予生理鹽水灌服;其余40只為造模組,前8周給予12 mg/kg的TAA灌胃,第9～12周給予36 mg/kg的TAA灌胃。在第9周開始,將造模組隨機分為模型組、乳果糖組、清毒湯(高、中、低劑量)組,均為10只。清毒湯(高、中、低劑量)組每天1次灌服清毒湯濃縮液,劑量分別為11.9 g/kg、5.95 g/kg、2.98 g/kg,乳果糖組每天1次灌服3.5 mL/kg乳果糖,模型組給以同等容積的生理鹽水灌服作為對照。所有組連續給藥至第12周。

1.5 標本制備

第12周末,大鼠禁食12～14小時后,用10%水合氯醛按3.5 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,注射于無菌真空采血管,離心后取上清分裝,置于-80℃冰箱保存備用。將部分新鮮肝組織置入4%多聚甲醛中,置-4℃冰箱保存,其余肝組織置入凍存管,-80℃冰箱保存。

1.6 指標檢測

將新鮮肝組織石蠟包埋、切片、HE染色,用顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。ET、TNF-α采用酶聯免疫吸附法檢測嚴格按照試劑盒說明執行。取肝組織裂解后的上清液抽提蛋白,經封閉、一抗孵育、二抗孵育后,膠片定影,用圖像分析軟件分析,目的蛋白表達量以目的蛋白/β-actin的灰度比值表示。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠肝臟組織病理形態學變化

大鼠肝組織HE染色結果顯示:正常大鼠肝組織切片未見明顯異常,肝細胞排列呈條索狀,無細胞變性、壞死以及炎性細胞浸潤;模型組大鼠肝組織見肝細胞結構紊亂,細胞變性、壞死及炎性浸潤顯著;各治療組肝組織損傷較模型組均有不同程度的改善,尤其清毒湯中劑量組肝細胞排列沒有明顯破壞,較模型組顯著改善。結果見圖1。

2.2 各組大鼠血清ET和TNF-α含量結果

與正常組比較,模型組血清ET和TNF-α含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組和清毒湯中、低劑量組ET和TNF-α含量顯著降低(P＜0.01),而清毒湯高劑量組TNF-α含量明顯降低(P＜0.05),而ET含量差異無統計學意義(P＞0.05);與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組ET、TNF-α含量和高劑量組血清TNF-α含量顯著降低(P＜0.01),清毒湯低劑量組差異無統計學意義(P＞0.05),高劑量組ET及TNF-α水平明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。由此提示大鼠實驗性肝損傷內毒素血癥模型造模成功,清毒湯具有降低實驗性肝損傷大鼠血清內毒素ET和TNF-α含量的作用,其中劑量組效果最明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當。結果見表1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態的變化(HE染色×200)

2.3 Western Blot檢測肝組織中NF-κB蛋白表達量

各組任取6只大鼠檢測肝組織NF-κB蛋白表達量。與正常組比較,模型組大鼠肝組織的NF-κB蛋白表達量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,各治療組NF-κB蛋白表達量顯著降低(P＜0.01)。提示清毒湯可以抑制實驗性肝損傷大鼠肝組織NF-κB的過度表達。見表2、圖2。

3 討論

中醫學中并沒有內毒素一詞,但內毒素是中醫熱毒之邪重要的物質基礎之一[2]。有學者認為,中醫“毒邪”與現代醫學“內毒素”之間存在著密切的相關性[3],故大多學者從“毒邪”論治內毒素血癥。劉鐵軍等[4]認為采用“下法”能通腑實、祛毒邪、使毒性物質從腸道排出,從而切斷腸肝循環,減輕或延緩肝性腦病的發展。本課題組采用國家級名老中醫王融冰教授的經驗方——清毒湯進行動物試驗研究,清毒湯由小承氣湯(出自《傷寒論》)加減化裁而來,具有清熱解毒、通腑攻下、滋陰涼血的功效,可以有效地減少血中內毒素,阻斷內毒素對肝臟的繼發性損傷。

表1 各組大鼠血清中ET和TNF-α含量比較(±s)

表1 各組大鼠血清中ET和TNF-α含量比較(±s)

注:與正常組比較,aP＜0.01;與模型組比較,bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較,dP＜0.05,eP＜0.01

組別 n E T ( E U / L ) T N F -α ( n g / m L ) 8 7 0 . 0 1 ± 1 3 . 4 1 5 5 . 8 6 ± 1 3 . 9 7模型組 8 1 0 9 . 3 3 ± 1 2 . 4 4 a 2 4 0 . 8 4 ± 3 7 . 8 6a乳果糖組 8 9 2 . 3 3 ± 4 . 5 6c 1 2 0 . 1 4 ± 1 4 . 6 7c清毒湯低劑量組 8 9 2 . 8 7 ± 4 . 6 3c 1 2 6 . 8 7 ± 1 1 . 5 1c清毒湯中劑量組 8 7 6 . 9 3 ± 7 . 5 8ce 7 9 . 2 2 ± 5 . 6 5ce清毒湯高劑量組 8 1 0 1 . 8 7 ± 1 . 6 9d 1 6 9 . 0 7 ± 6 . 9 2正常組b e

表2 各組大鼠肝組織中NF-κB蛋白表達量比較

圖2 各組大鼠肝組織中NF-κB蛋白表達

近年來研究證實,內毒素既可以直接損傷肝細胞,誘導肝細胞凋亡,也可以通過激活枯否細胞(kupffer cell,KC),誘導NF-κB活化發生級聯反應,從而釋放多種細胞因子 TNF-α、白細胞介素-1 (interleukin 1,IL-1)、IL-6等,對肝臟進行“第二次打擊”,促進肝病的重癥化與慢性化[5],最終導致肝功能衰竭。其中NF-κB在調控促炎基因的合成和釋放中起決定性作用[6],NF-κB被激活后,從細胞質轉入細胞核,與DNA分子特定基因結合,從而啟動多種炎性細胞因子(如TNF-α、IL-1等)基因的轉錄[7]。TNF-α被認為是內毒素發揮毒性效應最重要的介質,不僅可以直接作用于肝細胞引起細胞的凋亡和壞死,還可以誘導其他炎性因子如IL-1,IL-6等產生,從而參與炎癥反應[8]。臨床研究發現, TNF-α、NF-κB可作為判斷肝內炎癥變化的有效指標[9]。

本實驗結果顯示,模型組大鼠血清ET及TNF-α水平、肝組織NF-κB蛋白表達量較正常組顯著升高,而治療組ET、TNF-α及NF-κB水平較模型組有不同程度改善,尤其是清毒湯中劑量組效果最佳。同時,各組大鼠肝組織的病理變化提示清毒湯中劑量組較模型組肝損傷顯著減輕。故推測清毒湯方通過抑制NF-κB表達,減少TNF-α入血,改善肝臟病理結構,以清除內毒素,達到保護肝臟的作用。但是,鑒于中藥復方合劑的多重作用,清毒湯治療肝病的機制有待進一步深入研究。

[1] 張文思,陳曉蓉.中藥灌腸治療重型肝炎的臨床研究現狀[J].西部中醫藥,2015,28(1):134-137.

[2] 高連印,車念聰,張秋云,等.清毒湯對硫代乙酰胺致肝損傷內毒素血癥模型大鼠血清內毒素及IL-6水平的影響[J].中醫學報,2013,28(8):1165-1167.

[3] 龍富立,毛德文,王秀峰,等.中醫藥治療肝病內毒素血癥的研究進展[J].中華中醫藥學刊,2011,29(5):1028-1030.

[4] 劉鐵軍,王立穎,李敏,等.下法與腸肝循環的關系及在肝性腦病中的應用[J].中西醫結合肝病雜志,2002,12(3):186-187.

[5] Yang JM,Han DW,Xie CM,et al.Endotoxins enhance hepatocarcinogenesis induced by oral intake of thioacetamide in rats[J]. World JGastroenterol,1998,4(2):128-132.

[6] Demirbilek S,Akin M,Gurunluoglu K,et al.The NF-kappaB inhibitors attenuate hepatic injury in bile duct ligated rats[J]. Pediatr Surg Int,2006,22(8):655-663.

[7] Wang T,Zhang X,Li JJ.The role of NF-kappaB in the regulation of cell stress responses[J].Int Immunopharmacol,2002,2(11): 1509-1520.

[8] Billiar T R,Curran R D,Harbrecht B G,et al.Modulation of nitrogen oxide synthesis in vivo: NG-monomethyl-L-arginine inhibits endotoxin-induced nitrate/nitrate biosynthesis while promoting hepatic damage[J].J Leukoc Biol,1990,48(6): 565-569.

[9] 袁淑芳,張麗娟,鄭嶸炅,等.NF-κB、TNF-α與乙型肝炎患者肝細胞損傷和肝纖維化的關系[C]//第三屆全國病毒性肝炎慢性化重癥化基礎與臨床研究進展學術會議論文集,重慶, 2013:173-179.

Effects of Qingdu decoction on TNF-αand NF-κB expressions in the rats w ith experimental severe liver injury

CAOWu-bing,GAO Lian-yin,CHE Nian-cong,et al.Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100069,China

GAO Lian-yin,E-mail:gly066@sina.com

Objective To observe the effects of Qingdu decoction on the expressions of endotoxin (ET),Tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and Nuclear factor kappa B(NF-κB)in ratswith severe liver injury and explore themechanism of Qingdu decoction on treating Chronic severe hepatitis complicated with endotoxemia.Methods The severe liver injury ratmodel was induced by Thioacetamide(TAA), and treated with Qingdu decoction.And then the blood level of ET,TNF-αand NF-κB were measured. Results The expression levels of ET,TNF-αand NF-κB inmodelgroup were significantly increased when compared to that of in normal group(P＜0.01).Compared to the model group,the expression levels of ET,TNF-αand NF-κB were decreased significantly in themiddle and low dose Qingdu decoction groups and Lactulose group(P＜0.01).All indexes except ET in the high dose Qingdu decoction group were decreased significantly(P＜0.05).Compared to lactulose group,the expressions of ET and TNF-αin the middle dose Qingdu decoction group were decreased significantly(P＜0.01),while the expressions of ET and TNF-αin the low dose group showed no significantly difference(P＞0.05).The expressions of ET and TNF-αin the high dose group were significantly higher than the Lactulose group(P＜0.05). Conclusions Qingdu decoction can improve liver injury and decrease ET,TNF-αand NF-κB expression levels in rats with hepatic injury complicated with endotoxemia,especially in the middle dose group.The mechanism could be related to the inhibition of NF-κB activity.

Liver injury; Endotoxin; Thioacetamide; Tumor necrosis factor alpha; Nuclear factor kappa B

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.10.009

2015-05-20)

(本文編輯:董歷華)

北京市自然科學基金(7142023);北京市教委課題(KM2011100025206)

100069北京,首都醫科大學中醫藥學院[曹吳冰(碩士研究生)、高連印、車念聰、張秋云、杜宇瓊、羅佳佳(碩士研究生)];首都醫科大學校醫院內科(付修文);首都醫科大學附屬北京地壇醫院中西醫結合科(王融冰)

曹吳冰(1990-),女,2013級在讀碩士研究生。研究方向:中醫藥防治慢性肝病內毒素血癥機制研究。E-mail:xk.bangbang@163.com

高連印(1966-),博士,副教授,碩士生導師。研究方向:中醫藥防治慢性肝病機制研究。E-mail: gly066@sina.com

【關鍵詞】肝損傷; 內毒素; 硫代乙酰胺; 腫瘤壞死因子α; 核轉錄因子κB