超高效合相色譜法定性與定量分析補腎健腦顆粒

朱瑞娟王 波 胡芳 李燦柳小亞封士蘭*周圍*

1(蘭州大學藥學院,蘭州 730000) 2(甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心,蘭州 730000)

超高效合相色譜法定性與定量分析補腎健腦顆粒

朱瑞娟1王 波2胡芳1李燦1柳小亞1封士蘭*1周圍*2

1(蘭州大學藥學院,蘭州 730000)2(甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心,蘭州 730000)

用超高效合相色譜法(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)建立補腎健腦顆粒及各藥材提取物的指紋圖譜,對補腎健腦顆粒主要色譜峰進行歸屬分析,并測定有效成分β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量。樣品經乙醇提取后,進樣1 μL,用Waters ACQUITY UPC2TMBEH柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)分離,柱溫為40℃,以超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇溶液為流動相,梯度洗脫,流速為0.8 mL/min。分析補腎健腦顆粒和各藥材提取物的UPC2指紋圖譜,利用各峰相對保留時間、紫外光譜圖及部分對照品歸屬主峰。結果表明,補腎健腦顆粒UPC2指紋圖譜中15個主峰來源明確,其中12號峰為β-蛻皮甾酮,含量為380 μg/g, 15號峰為松果菊苷,含量為9.562 mg/g。與HPLC和UPLC法相比,本方法簡便、快速,精密度高,重現性好。

超高效合相色譜;補腎健腦顆粒;β-蛻皮甾酮;松果菊苷

1 引 言

補腎健腦膠囊臨床上主要用于治療兒童多動癥,且療效顯著[1]。但該制劑存在工藝簡單粗糙,服用量大,質量難以控制,小兒服用順應性不好的缺點,并且沒有定性定量方法控制其質量。因此本研究在保證療效的基礎上將補腎健腦膠囊制成顆粒劑,克服了其服用困難的缺陷,并采用色譜法對該制劑進行定性與定量分析,以控制其質量。補腎健腦顆粒是由肉蓯蓉、懷牛膝、遠志、石菖蒲等藥材經過提取、濃縮、干燥、粉碎、制粒工序制成的復方制劑。本研究用HPLC法和UPLC法分析補腎健腦顆粒,在多次優化色譜條件后,都不能將β-蛻皮甾酮和松果菊苷分離。因此,采用一種新的分離技術—超高效合相色譜(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)[2,3],建立了補腎健腦顆粒及其組成藥材的指紋圖譜,歸屬分析了補腎健腦顆粒指紋圖譜中主要色譜峰,并建立β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量測定方法,該方法能將β-蛻皮甾酮和松果菊苷有效分離,與HPLC和UPLC方法相比,更簡便、快速,且分離度高,重復性好。本實驗利用UPC2定性定量分析了補腎健腦顆粒,在復雜中藥制劑質量控制方面提供了新的思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

2695高效液相色譜儀、2996PDA檢測器(Waters公司);ACQUITY超高效液相色譜儀、ACQ-PDA檢測器(Waters公司);ACQUITY超高效合相色譜儀、ACQ-UPC2-PDA檢測器(Waters公司);KQ-400DB超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);EYELAOSB-2100旋轉蒸發儀(日本東京理化)。

松果菊苷(MUST-13072403)、β-蛻皮甾酮(MUST-12122111),均購自上海順勃生物技術有限公司;乙腈(色譜純,德國莫克公司);H3PO4(分析純,北京化工廠);甲醇(分析純,天津北方天醫化學試劑廠);甲醇(色譜純,山東禹王試劑公司);純凈水(蘭州大學第一醫院生產);補腎健腦顆粒(三批中試樣品,由蘭州中醫院腦病康復醫院提供);肉蓯蓉、懷牛膝、遠志、石菖蒲藥材由蘭州黃河藥市提供。

2.2 色譜條件

采用Acqtity UPC2BEH色譜柱;系統背壓為1800 psi;色譜柱溫度為40℃;柱流速為0.8 mL/min;進樣量為1 μL;流動相分別為超臨界CO2(流動相A)和0.05%H3PO4-甲醇溶液(流動相B),梯度洗脫:0～0.3 min,99%A;0.3～4 min,99%～90%A;4～16 min,90%～70%A;16～18 min,70%～60%A; 18～20 min,60%A;20～21 min,60%～99%A;21～25 min,99%A。檢測波長248 nm。

2.3 對照品溶液的制備

稱取松果菊苷對照品16.65 mg,加50%甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中,得666 mg/L的松果菊苷對照品溶液。稱取β-蛻皮甾酮對照品1.62 mg,用甲醇溶解并定容至50 mL,得32.4 mg/L β-蛻皮甾酮對照品溶液。

2.4 樣品溶液的制備

補腎健腦顆粒制備:按處方比例稱取肉蓯蓉、遠志、懷牛膝、石菖蒲等適量,煎煮,收集濾液、濃縮、干燥、粉碎、加適量輔料制粒得補腎健腦顆粒。陰性樣品制備:按上述方法分別制備缺肉蓯蓉和缺懷牛膝的陰性樣品。

藥材提取物的制備:按處方分別稱取各藥材適量,按照處方提取工藝提取,收集濾液,濃縮,干燥,得藥材提取物。

2.5 供試品溶液的制備

分別取補腎健腦顆粒約1.00 g,各藥材提取物約0.50 g,精密稱定,置于50 mL圓底燒瓶中,加90%乙醇25 mL,回流提取2次,每次1 h,合并濾液,回收乙醇,殘渣用甲醇溶解定容至25 mL,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

3 結果與討論

3.1 提取溶劑及提取條件的選擇

本研究旨在盡可能多且完全地提取樣品中的有效成分,根據各藥材所含主要有效成分的性質,本實驗分別以50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、甲醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇對補腎健腦顆粒及各藥材提取物進行超聲和回流提取,結果表明,90%乙醇回流提取,提取物指紋圖譜中峰最多。又考察提取時間和提取次數對提取效率(峰面積)的影響,結果表明,25 mL溶劑提取兩次,每次30 min,提取效率最高。

3.2 色譜條件的選擇

考察了色譜柱對樣品分離效果的影響,分別選用ACQUITY UPC2TMHSS C18SB柱和ACQUITY UPC2TMBEH柱進樣分析,結果表明,在本實驗條件下ACQUITY UPC2TMBEH柱對樣品峰有較好的分離效果。由于流動相對分離效果影響很大,本實驗分別用超臨界CO2-甲醇、超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇、超臨界CO2-乙腈、超臨界CO2-0.05%H3PO4-乙腈梯度洗脫,結果表明,有機溶劑采用甲醇時,樣品峰有較好的分離,但有些峰峰形不好,稍有拖尾、峰形展寬。向有機溶劑中加入少量H3PO4,配成0.05%H3PO4-甲醇溶液,能改善峰形展寬及拖尾現象。因此選擇超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇作為流動相。

3.3 紫外檢測波長的選擇

對樣品進樣分析,全波長掃描。結果248 nm波長下的指紋圖譜樣品峰數最多,且吸收相對較強,易于主峰歸屬研究。因此最終選擇248 nm作為檢測波長。

3.4 方法學考察

3.4.1 專屬性考察取供試品溶液、對照品溶液、陰性供試品溶液,按2.2節進樣檢測,比較陰性樣品色譜圖與對照品和樣品色譜圖(圖1),在松果菊苷和β-蛻皮甾酮峰吸收位置無干擾,表明本方法專屬性好。

3.4.2 線性考察取松果菊苷對照品溶液1.00,1.25,1.67,2.50,5.00和10.00 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,用50%甲醇溶解并定容,得到質量濃度分別為66.60,83.25,111.00,166.50,333.00和666.00 mg/L的系列溶液。按照上述色譜條件,每個濃度依次進樣1 μL,以濃度(mg/L)為橫坐標,以峰面積為縱坐標,進行線性回歸。取β-蛻皮甾酮對照品溶液1.00,1.25,1.67,2.50,5.00和10.00 mL,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到質量濃度分別為 3.24,4.05,5.40,8.10,16.20和32.40 mg/L的系列溶液。同樣色譜條件下,每個濃度依次進樣1 μL,以濃度(mg/L)為橫坐標,以峰面積為縱坐標,進行線性回歸(表1)。補腎健腦顆粒在16min內得到良好分離,在一定濃度范圍內,松果菊苷和β-蛻皮甾酮呈現良好的線性關系(r＞0.9996),精密度RSD＜2%。

圖1 UPC2色譜圖(248 nm)A陰性;B補腎健腦顆粒(12 β-蛻皮甾酮;15松果菊苷);C對照品(12 β-蛻皮甾酮;15松果菊苷)Fig.1 Ultra performance convergence chromatograms(UPC2)(248 nm)of(A)negative;(B)Bushen Jiannao grains(12 β-ecdysterone;15 echinacoside)and(C)standard(12 β-ecdysterone standard;15 echinacoside)

表1 松果菊苷和β-蛻皮甾酮的線性關系Table 1 Linear relationship of echinacoside and β-ecdyserone

3.4.3 精密度、重復性、加樣回收率試驗分別對精密度、重復性、加樣回收率進行考察,松果菊苷和β-蛻皮甾酮日內精密度的RSD分別為0.4%和0.3%;重復進樣6次,兩個化合物的峰面積RSD分別為0.5%和0.5%;加樣回收實驗(表2和表3)顯示,松果菊苷和 β-蛻皮甾酮的加樣回收率分別在99.7%～100.2%和99.8%～100.5%范圍內。結果表明,本實驗儀器精密度高,方法準確可靠、重復性好。

表2 松果菊苷加樣回收實驗結果Table 2 Recovery of echinacoside

表3 β-蛻皮甾酮加樣回收率實驗結果Table 3 Recovery of β-ecdyserone

3.5 UPC2與HPLC、UPLC對比分析

取2.5節制備的補腎健腦顆粒供試品溶液,在優化條件下,分別用Waters高效液相色譜儀、超高效液相色譜儀和超高效合相色譜儀分析,248 nm下檢測。HPLC和UPLC指紋圖譜(圖2A和2B)顯示,兩種方法都不能將補腎健腦顆粒成分有效分離,且峰很少。而UPC2法(圖2C)與HPLC和UPLC法相比,樣品出峰數量明顯增多且各峰分離很好,松果菊苷和β-蛻皮甾酮峰均無干擾,且UPC2分析時間較HPLC縮短一半,充分體現了UPC2簡便、快速、高分離度的特點。

圖2 UPC2色譜圖(248 nm)(A)補腎鍵腦顆粒;(B)遠志;(C)肉蓯蓉;(D)石菖蒲;(E)懷牛膝Fig.2 Ultra performance convergence chromatogram(UPC2) (248 nm) of(A) Bushen Jiannao grains, (B)Polygala tenuifolia,(C)Cistanche and(D)Acorus graminus and(E)Achyranthes

3.6 樣品的測定

取3批補腎健腦顆粒中試樣品和各藥材提取物適量,分別按2.4節制備供試品溶液,按2.2節方法檢測,得到UPC2指紋圖譜(圖3)。計算補腎健腦顆粒中β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量,并通過保留時間和紫外光譜圖歸屬其UPC2指紋圖譜中主峰來源。結果表明,β-蛻皮甾酮(12號峰)平均含量為380 μg/g,松果菊苷(15號峰)平均含量為9.562 mg/g。各主峰來源明確,結果見表4。

圖3 色譜圖(248 nm)A補腎健腦顆粒HPLC圖(1,松果菊苷;2,β-蛻皮甾酮);B UPLC圖(1,松果菊苷; 2,β-蛻皮甾酮);C UPC2圖(12,β-蛻皮甾酮;15,松果菊苷)Fig.3 Chromatogram(248 nm).(A)HPLC chromatogram of bushen jiannao grains(1,echinacoside;2,β-ecdyserone);(B)UPLC chromatogram(1,echinacoside;2,β-ecdyserone);(C)UPC2chromatogram(12,β-ecdyserone; 15,echinacoside)

肉蓯蓉的主要有效成分為苯乙醇苷類,其中松果菊苷含量較高[4～7],常以松果菊苷含量作為肉蓯蓉質量控制指標。懷牛膝的主要活性成分為蛻皮甾酮等[8],常以β-蛻皮甾酮作為懷牛膝質量控制指標。石菖蒲的主要有效成分是α-細心醚和β-細辛醚[9],該制劑為水煎煮,無法檢測到α-細心醚和β-細辛醚。遠志的主要有效成分為皂苷類[9～11],文獻[12～14]報道,遠志和石菖蒲配伍時,遠志中皂苷元含量大幅度降低,本實驗嘗試檢測了遠志皂苷,但在該制劑中未檢測到。因此,本研究最終選擇了以松果菊苷和β-蛻皮甾酮作為補腎健腦顆粒定量分析指標,指紋圖譜中其他主要色譜峰作為定性分析指標。

本實驗建立的UPC2方法,簡便、快速,與HPLC和UPLC相比,既節省時間、溶劑,又能使補腎健腦顆粒樣品峰完全分離,體現了其環保,高靈敏度,高分離度的優勢。可用于復雜中藥制劑質量的監測。

表4 各峰歸屬分析結果Table 4 Identification of each peak

1 SHI Jian-Gang.Journal of Pediatrics of Traditional Chinese Medicine.,2012,8(5):50-51

史建鋼.中醫兒科雜志,2012,8(5):50-51

2 XU Yong-Wei,SUN Qing-Long,HUNG Jing,TAN Xiao-Jie.Modern Instruments.,2012,18(5):45-48

徐永威,孫慶龍,黃靜,譚曉杰.現代儀器,2012,18(5):45-48

3 LI Zhong-Hao,WU Shuai-Bin,LIU Shan-Shan,FAN Zi-Yan,YANG Fei,BIAN Zhao-Yang,TANG Gang-Ling,CHEN Zai-Gen,HU Qing-Yuan.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41(12):1817-1824

李中皓,吳帥賓,劉珊珊,范子彥,楊 飛,邊照陽,唐綱嶺,陳再根,胡清源.分析化學,2013,41(12):1817-1824

4 LEI Li,SONG Zhi-Hong,TU Peng-Fei.Chinese Traditional and Herbal Drugs.,2003,34(5):473-476

雷麗,宋志宏,屠鵬飛.中草藥,2003,34(5):473-476

5 LI Qing-Bao,YANG Lai-Xiu,YANG Shu-Qing.Inner Mongolia Medical Journal.,2003,35(6):537-538

李慶寶,楊來秀,楊樹青.內蒙古醫學雜志,2003,35(6):537-538

6 XU Chao-Hui,YANG Jun-Shan,Lü Rui-Mian.Chinese Traditional and Herbal Drugs.,1999,30(4):244-246

許朝暉,楊峻山,呂瑞綿.中草藥,1999,30(4):244-246

7 HU Jia-Qi,FENG Jia-Yuan.Clinical Journal of Chinese Medicine.,2012,15(4):26-28

胡佳琦,馮佳媛.中醫臨床研究,2012,15(4):26-28

8 ZHAO Wan-Ting,MENG Da-Li,LI Xian,LI Wei.Journal of Shenyang Pharmaceutical University.,2007,24(4): 207-210

趙婉婷,孟大利,李銑,李魏.沈陽藥科大學學報,2007,24(4):207-210

9 JIANG Yong,TU Peng-Fei.Journal of Peking University(Health Sciences).,2004,36(1):94-98

姜勇,屠鵬飛.北京大學學報(醫學版),2004,36(1):94-98

10 FU Jing,ZHANG Dong-Ming,CHEN Ruo-Yun.Chinese Traditional and Herbal Drugs.,2006,37(1):144-146

傅晶,張東明,陳若蕓.中草藥,2006,37(1):144-146

11 ZHANG Xiao-Ping.Heilongjiang Medicine Journal.,2004,17(2):139-140

張曉萍.黑龍江醫藥,2004,17(2):139-140

12 YANG Xiao-Yan,CHEN Fa-Kui.Journal of Shenyang Pharmaceutical University.,1999,16(1):71-78

楊曉燕,陳發奎.沈陽藥科大學學報,1999,16,(1):71-78

13 ZHANG Wen-Juan,ZHENG Xiao-Hui,FANG Min-Feng,WANG Qing-Wei,CHEN Huan,LI Yun-Feng,ZHANG Yan. China Pharmaceuticals.,2009,18(15):6-7

張文娟,鄭曉暉,房敏峰,王慶偉,陳煥,李云峰,張琰.中國藥業,2009,18(15):6-7

14 HAN Yi-Li,LUO Feng-Juan,WANG Ying-Li.Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine.,2011, 18(3):67-68

韓毅麗,羅鳳娟,王穎莉.中國中醫藥信息雜志,2011,18(3):67-68

藥典委搭建開放、公益、合作實驗平臺新版藥典亟需高精尖技術支持

近日,中國藥典委員會在北京為其“ChP-Waters聯合開放實驗室”舉行建設座談會暨揭牌儀式。中國藥典委員會秘書長張偉表示:“聯合開放實驗室的舉辦是中國藥典委員會自身發展的需求,也是更好地開展藥典標準制定、滿足公眾用藥安全的需求,是中國藥典委員會不斷深化藥品標準形成機制改革的新探索和新嘗試。”

記者了解到,聯合開放實驗室作為一個公益項目,自宣布開建以來就獲得行業的廣泛關注。

張偉介紹,實驗室聚集社會各種資源打造而成,旨在充分履行其開放、公益、創新和互利的使命,更好地服務和貢獻于中國藥典研究。“在實驗室今后的發展運營中,仍然要堅持公益性,堅持為社會服務的宗旨,更希望有更多的企業和社會力量能加入到這一公益事業中來。”張偉強調。

“ChP-Waters聯合開放實驗室”設立于北京振東光明藥物研究院實驗大樓內,面積約400多平米。一方面將深入開展藥典標準研究,檢測方法和開發與驗證工作;同時開展國內外藥典標準的分析方法,及各論的數據比對工作。實驗室還將為藥品監管及藥品生產科研人員提供培訓,并就藥物開發研究開展廣泛的國際間技術交流。

鑒于實驗室的開放性,各承擔藥典科研任務單位可根據需要,申請來人或帶課題到實驗室利用先進、新型的儀器設備進行試驗研究。雙方希望實驗室最終成為中國藥品標準領域的一個國家級技術支持中心。

沃特世(Waters?)公司和世界各地的藥典委員會都有著非常廣泛、深入的合作,各個國家的制藥行業面臨著不同的挑戰。中國藥典包括很多傳統藥物、中藥,這些化合物的組成復雜得多,相應的分析和理解也就更困難。沃特世可以幫助中國藥典針對這方面的內容,比如中藥的分析、理解、驗證、鑒別等,提供更高效的咨詢服務、進行深度合作。”

Qualitative and Quantitative Analysis of Bushen Jiannao Grains by Ultra Performance Convergence Chromatography

ZHU Rui-Juan1,WANG Bo2,HU Fang1,LI Can1,LIU Xiao-Ya1,FENG Shi-Lan*1,ZHOU Wei*2
1(Department of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)
2(Central Laboratory of Technical Gansu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureall,Lanzhou 730000,China)

An ultra performance convergence chromatographic(UPC2)method was established for the attribution analysis of the main peaks as well as the quantitative determination of echinacoside and β-ecdyserone in Bushen Jiannao Grains.The samples were extracted with ethanol and separated on Waters ACQUITY UPC2TMBEH column(100 mm×3.00 mm,1.7 μm),with a gradient supercritical CO2-0.05% phosphoric acid-methanol solvent system at 40℃.The flow rate was 0.8 mL/min,the detection wavelength was set at 248 nm and the injection volume was 1 μL.Results showed that all the main peaks in the fingerprint were clearly attributed.The peak named 12 was β-ecdyserone with the content of 380 μg/g and the peak named 15 was echinacoside with the content of 9.562 mg/g.The method was simple,eco-friendly, accurate and reliable compared with HPLC and UPLC.

Ultra performance convergence chromatography;Bushen Jiannao Grains; Echinacoside; β-Ecdyserone

31 July 2014;accepted 18 September 2014)

2014-07-31收稿;2014-09-18接受

本文系蘭州市科技三項經費項目(No.2012-2-70)資助

*E-mail:fengshl@lzu.edu.cn;zhouwei845@163.com

10.11895/j.issn.0253-3820.140655