塞來昔布聯合放療對人膽管癌細胞凋亡的作用研究

王陽 鄒明雷 呂晶晶 付培彪

[摘要] 目的 研究人膽管癌細胞在塞來昔布和放療作用下發生凋亡的作用機制。 方法 將QBC939細胞株分為四組：對照組、塞來昔布組（C組）、放療組（R組）和塞來昔布聯合放療組（C+R組，聯合組），分別進行不同濃度的塞來昔布和不同劑量X線作用后，采用CCK-8法、流式細胞技術和Western blot等方法分別檢測各組細胞生長、凋亡率及survivin蛋白的表達。 結果 聯合組的凋亡率明顯增加，從3.527%升至23.364%（P<0.05），survivin蛋白表達明顯降低（P<0.05）。 結論 應用塞來昔布對接受放療的人QBC939細胞株有凋亡增敏作用，下調survivin的表達是其機制之一。

[關鍵詞] 塞來昔布；膽管細胞癌；放療；survivin基因

[中圖分類號] R735.8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）10-0019-03

膽管細胞癌是膽道系統常見的惡性腫瘤，因其解剖位置特殊，早期診斷較困難，可手術切除的患者不到20%，放化療是中晚期患者主要治療手段，但放療效果受到腫瘤敏感性的限制。塞來昔布作為一種COX-2抑制劑，在近年研究中被認為具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用[1，2]。本研究探討體外條件下塞來昔布對接受X線放療的人QBC939細胞凋亡的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料及細胞培養

QBC939人膽管癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，塞來昔布購自南京德寶生化有限公司，細胞培養基為含10%胎牛血清的1640培養基，兔抗人survivin多克隆抗體及β-actin購自Santa-Cruz公司，CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物科技研究所。細胞培養條件：37℃、5%CO2的培養箱。實驗設計及研究時間2012年1月～2013年1月。

1.2 CCK-8法檢測細胞生長

取傳代培養的對數生長期QBC，939細胞制成1×105個/L細胞懸液，種植在96孔板中，每孔100 μL。設為調零組（不含細胞的培養液），對照組（常規培養細胞，不接受塞來昔布及放療），實驗組（分別加入濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞來昔布，X線放療劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy），實驗組每組設10個復孔。培養48 h后實驗組每孔加CCK-8試劑10 μL，再培養2 h后，用酶標儀在450 nm波長下測定每孔的吸光度，計算細胞增殖抑制率，并進一步計算出塞來昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后續實驗中選擇濃度65 μmol/L塞來昔布。X線放療的IC50為5.83 Gy，選擇劑量6 Gy用于后續實驗。抑制率=（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.3 流式細胞術檢測

將實驗分為四組，每組樣本數為10，分組設置如下：對照組單純培養細胞；塞來昔布組（C組）加入濃度65 μmol/L塞來昔布；放療組（R組）給予劑量6 Gy X線照射；塞來昔布聯合放療組（C+R組）先給予濃度65 μmol/L塞來昔布24 h后更換培養液，再給予劑量6 Gy的X線照射細胞，各組細胞均培養48 h，收集細胞并離心，按試劑盒說明書進行檢測，凋亡細胞的比例由Cell Quest Pro 軟件計算，實驗重復3次。

1.4 Western blot蛋白檢測

收集上述各組細胞，每組樣本數為10，加入細胞裂解液，提取總蛋白，調整各組總蛋白，使各組總蛋白濃度相同。經15%SDS-PAGE電泳后電轉移至PVDF膜，封閉后加入一抗（兔抗人survivin多克隆抗體），工作濃度為1∶1000，再加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體），工作濃度為1∶6000。同樣方法進行內參蛋白（β-actin）的抗體孵育。發光、顯影、定影后制成膠片，掃描后用凝膠圖像處理體統分析目標條帶的凈光密度值。

1.5 統計學分析

采用SPSS18.0統計學軟件進行處理，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞的凋亡率

如圖1所示每組細胞的流式圖，結果顯示聯合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組（P<0.05，見表1）。結合圖1及表1結果，推斷塞來昔布對QBC939的X線放療有增敏作用。

2.2 Survivin蛋白的表達

聯合組survivin蛋白表達較其他各組要明顯減弱（圖2），用相關軟件計算出各條帶的灰度值，將目的蛋白survivin/β-actin灰度值作為最終結果，以x±s表示（表1），多組之間比較差異有統計學意義（P<0.05），提示聯合組survivin蛋白表達下降，從而加速細胞凋亡。

3 討論

放射療法作為治療腫瘤的一種傳統手段，其療效受到腫瘤放療敏感性的限制。目前研究發現大部分腫瘤對輻射并不敏感，在很大程度上影響了放療效果。如何通過提高腫瘤的放射敏感性以提高放療療效，是近年來研究的熱門之一。塞來昔布是一種環氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑，其放射增敏作用在近年研究中受到重視[2-4]。研究發現，環氧合酶-2（COX-2）在上皮組織癌（包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、皮膚的鱗狀上皮細胞癌等）中廣泛存在且過度表達，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[4]。COX-2促進前列腺素E2（PGE2）生成，而PGE2具有放射保護作用，而放射治療在殺滅腫瘤細胞的同時誘導腫瘤細胞高表達COX-2[4，5]。塞來昔布屬于非甾體類抗炎藥（NSAIDs），是一種選擇性環氧化酶抑制劑，可通過抑制環氧化酶-1及環氧化酶-2來阻止花生四烯酸向前列腺素轉化，從而阻止PGE2的放射保護作用，發揮放射增敏劑的作用。研究發現，塞來昔布作為一種新型COX-2選擇性抑制劑，可明顯降低消化道腫瘤的發病率[4]，塞來昔布通過抑制腫瘤細胞放射損傷的修復，改變腫瘤細胞的周期分布，抑制腫瘤新生血管形成以及誘導腫瘤細胞凋亡等機制，在聯合放射治療可提高放療療效，增強腫瘤細胞對放射的敏感性[5-7]。聶亮琴[7]等將正常少突膠質細胞（oln93）及腦膠質瘤細胞（u373）分別按空白處理、單獨接受塞來昔布或X射線、塞來昔布聯合X射線4種不同處理方式研究塞來昔布的放射增敏作用及其作用機制，發現塞來昔布能抑制oln93細胞和u373細胞生長，膠質瘤細胞組放射增敏比高于正常膠質細胞組，并誘導膠質瘤細胞G0/G1期阻滯，聯合組與照射組比較，u373細胞發生G2/M期阻滯，Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE1l蛋白表達下降，提示塞來昔布對u373的放射增敏作用比oln93細胞明顯，其機制與調節細胞周期分布及DNA損傷修復有關。

Survivin基因作為凋亡抑制家族的重要成員，是目前發現最強的凋亡抑制基因，survivin表達與腫瘤預后、放化療敏感性密切相關[8-11]。survivin與環氧化酶-2表達的關系是塞來昔布作用機制研究的方向之一。夏歷[12]等研究發現在胃癌組織中survivin的表達與COX-2相關。李偉忠等[13]通過研究環氧化酶-2抑制劑塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細胞COX-2、survivin表達的影響及誘導細胞凋亡的作用，發現塞來昔布下調survivin mRNA及其蛋白表達的同時抑制COX-2蛋白的表達，但對COX-2 mRNA表達的抑制作用較弱，提示COX-2抑制劑塞來昔布下調survivin表達的作用可能與抑制腫瘤細胞生長等作用有關。方雷[14]等通過設計合成survivin 的 siRNA 序列并轉染等方式研究survivin基因沉默對人胃癌MGC-803細胞增殖及對化療藥物塞來昔布敏感性的影響，發現 survivin基因沉默48 h后，MGC-803細胞的survivin基因和蛋白表達明顯降低（P<0.05），survivin基因沉默組細胞對塞來昔布的敏感性顯著增強，提示survivin特異性siRNA能顯著沉默MGC-803細胞survivin基因，抑制細胞增殖，并增強MGC-803細胞對塞來昔布的敏感性。

使用塞來昔布來降低survivin的表達從而增加放療的敏感性是本研究的設想之一。有研究發現在肝細胞癌中，PGE2可以激活EGFR/PI3K途徑，通過EP1受體來上調survivin的表達[15]。本研究中，Western blot法檢測到survivin蛋白的表達在聯合組中明顯下降，提示在QBC939細胞株中，塞來昔布可以加速survivin蛋白的分解或降低survivin的mRNA表達。本研究結果顯示，聯合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組，由此我們可以推斷，塞來昔布可以下調survivin表達，發揮放療增敏作用。

本研究通過塞來昔布聯合放療作用于人膽管癌QBC939細胞株，顯示塞來昔布能增強放療的敏感性，提高腫瘤細胞凋亡率，其機制之一可能是抑制survivin表達。本研究對膽管癌的治療提供了一種新思路，但是仍需更多研究來證實。

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（收稿日期：2015-01-09）