靶向VEGF—C的siRNA表達載體對人乳腺癌細胞VEGF—C基因表達的影響

楊輝++++++徐笑紅

[摘要] 目的 探討靶向VEGF-C的siRNA表達載體對人乳腺癌細胞MCF7增殖、凋亡及化療敏感性的影響。 方法 針對VEGF-C的siRNA表達載體轉染乳腺癌細胞，另設立轉染組及轉染陰性表達載體組，每組設5個復孔。觀察各組細胞的VEGF-C mRNA及蛋白表達情況。 結果 陰性對照組和空白對照組VEGF-C mRNA表達率無顯著差異（P>0.05）；實驗組各組的表達水平均顯著低于空白對照組及陰性對照組（P<0.01）；實驗A組的表達又顯著低于實驗B組和實驗C組（P<0.01）。陰性對照組和空白對照組培養液上清中VEGF-C蛋白水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組各組蛋白水平均顯著低于陰性對照組和空白對照組（P<0.01）；實驗A組蛋白水平又顯著低于實驗B組和實驗C組（P<0.01）。 結論 靶向VEGF-C的siRNA表達載體能夠顯著降低人乳腺癌細胞VEGF-C的基因和蛋白表達。

[關鍵詞] 人乳腺癌細胞；血管內皮生長因子C；蛋白

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）10-0001-04

Effect of siRNA expression vector of targeting the VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression

YANG Hui1 XU Xiaohong2

1.Cancer Chemotherapy Center， Ningbo Yinzhou People's Hospital， Ningbo 315000， China； 2.Cancer Chemotherapy Center， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To discuss the effect of siRNA expression vector of targeting VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression. Methods The siRNA expression vector of targeting VEGF-C transfected breast cancer cells， and another groups of expression vector transfected and transfected with negative were established. Each group set up five wells. VEGF-C mRNA and protein expression of all groups were compared. Results VEGF-C mRNA expression of negative control group and the control group showed no significant difference （P>0.05）. VEGF-C mRNA expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； expression of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. VEGF-C protein levels in culture supernatant of negative control group and the control group showed no significant difference（P>0.05）； VEGF-C protein levels in culture supernatant of expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； Level of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. Conclusion siRNA expression vector of targeting the VEGF-C can apparently decrease VEGF-C mRNA and protein expression on breast cancer cells.

[Key words] Breast cancer cells； Vascular endothelial growth factor-C； Protein

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤的發病中占首位。手術治療是根治乳腺癌的主要方法，但是術后復發轉移、化療耐藥可影響最終的治療效果。近年來隨著分析生物學的迅速發展，分子靶向治療成為新的熱點[1，2]。血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族的成員之一，與內皮細胞膜表面的血管內皮生長因子2、3結合，促進血管及淋巴管的增生，參與腫瘤的生長及轉移過程[3，4]。VEGF-C結合腫瘤細胞表面的受體后，能促進細胞的增殖，并能阻止細胞凋亡，降低腫瘤細胞的化療敏感性，靶向抑制VEGF-C基因的表達，對抑制腫瘤細胞的增殖具有一定的臨床意義。本研究主要探討靶向VEGF-C的siRNA表達載體對人乳腺癌細胞VEGF-C基因表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實驗研究時間：2013年4月～2014年12月。MCF-7人乳腺癌細胞株購自上海生博生物醫藥科技有限公司。靶向VEGF-C的siRNA真核表達質粒，陰性對照質粒。主要試劑：培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂質體LipofectamineTM 2000、Trizol試劑、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅱ、人VEGF-C ELISA試劑盒、SABC 組化試劑盒、DBA試劑盒、瓊脂糖、DEPC等。主要儀器：CO2恒溫培養箱、恒溫水浴箱、核酸蛋白檢測儀、離心機、電泳儀、電泳槽、PCR儀、酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復蘇、培養、傳代 乳腺癌細胞株經復蘇后，接種于培養瓶中，37℃，5%CO2恒溫培養，細胞80%融合時，進行傳代繼續培養。

1.2.2 質粒轉染細胞 （1）轉染用重組質粒DNA純化、定量。質粒抽提試劑盒提取靶向VEGF-C重組質粒（pRNAT-VEGF-C-1、pRNAT-VEGF-C-2、pRNAT-VEGF-C-3）及陰性對照質粒（P-N）。（2）轉染細胞。將細胞轉入24孔培養板，每孔3×105個，培養24 h，細胞達到90%融合。分別對細胞進行分組：空白對照組，未轉染；陰性對照組，轉染陰性對照質粒；實驗A組轉染pRNAT-VEGF-C-1質粒；實驗B組轉染pRNAT-VEGF-C-2質粒；實驗C組轉染pRNAT-VEGF-C-3質粒。制備脂質體/質粒DNA混合物。洗凈培養板各孔培養液，采用DMEM培養液清洗細胞2遍，加入DMEM培養基500 μL，加入脂質體-DNA復合物，總體積600 μL。每組5個復孔。空白對照組僅加DMEM培養基。37℃，5%CO2恒溫培養6 h，換液，加1 mL含10%FCS的DMEM過夜。

1.3 檢測方法

1.3.1 采用RT-PCR法檢測轉染細胞中VEGF-C mRNA表達 （1）提取總RNA。（1～5）×106細胞移入EP管中，離心，去上清。加入Trizol 1 mL混勻，室溫下放置5 min，加入氯仿200 μL，震蕩15 s，室溫下放置3 min。4℃離心15 min，將水相轉移到EP管中，加入等體積異丙醇混勻，放置20～30 min，4℃離心10 min，去上清，加75%乙醇1 mL洗滌沉淀。4℃離心5 min，倒出液體再次離心后，槍頭吸出少量液體，留下沉淀。室溫晾干，重復溶解RNA。4 μg RNA逆轉錄為cDNA。（2）PCR擴增。VEGF-C引物和β-actin引物由上海博雅生物公司合成提供。反應體系12.5 μL。瓊脂糖點凝膠電泳，分析電泳結果，VEGF-C表達率采用其吸光度值與內參照β-actin吸光度值比例表示。

1.3.2 采用ELISA法檢測細胞培養上清液中VEGF-C蛋白的表達 （1）每孔3×105個細胞接種于24孔培養板內，37℃，5%CO2培養24 h，細胞轉染。設置空白對照組、陰性對照組、實驗A組、實驗B組、實驗C組，同mRNA檢測。每組5個復孔。轉染后48 h，收集上清，采用ELISA法檢測上清液中的VEGF-C蛋白水平。

1.3.3 采用免疫細胞化學染色法檢測細胞內VEGF-C蛋白的表達水平 取對數生長的乳腺癌細胞，每孔3×105個接種于放有載玻片的培養板內，37℃，5%CO2培養24 h。細胞布滿80%后，進行細胞轉染，步驟和分組同上。每組5個復孔。采用免疫細胞化學染色法檢測細胞內VEGF-C蛋白表達。轉染后48 h，取出培養板，吸凈培養液，加甲醛固定，PBS沖洗3遍。取出載玻片，去離子水孵育，消除內源性過氧化物酶，加封閉液，加一抗過夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育20 min。PBS沖洗共3次，加SABC，孵育20 min，PBS沖洗共4次。DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯脫水，封片。

1.4 統計學方法

采用SPSS 12.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差表示，采用方差分析及t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒對乳腺癌細胞VEGF-C mRNA表達的影響

空白對照組表達率為（98.6±2.4）%，陰性對照組表達率為（98.1±2.0）%，實驗A組表達率為（38.2±1.6）%，實驗B組表達率為（64.2±1.8）%，實驗C組表達率為（67.9±1.9）%。陰性對照組和空白對照組VEGF-C mRNA表達率無顯著差異（P>0.05）；實驗組各組的表達水平均顯著低于空白對照組及陰性對照組（P<0.01）；實驗A組的表達又顯著低于實驗B組和實驗C組（P<0.01）。見圖1。

2.2重組質粒對乳腺癌細胞培養液上清液中VEGF-C蛋白水平的影響

陰性對照組VEGF-C蛋白水平為（383.51±30.26）pg/mL，空白對照組為（368.80±38.91）pg/mL，實驗A組為（116.38±25.16）pg/mL，實驗B組為（277.42±30.11）pg/mL，實驗C組為（291.46±33.15）pg/mL。陰性對照組和空白對照組培養液上清中VEGF蛋白水平比較差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組各組蛋白水平均顯著低于陰性對照組和空白對照組（P<0.01）；實驗A組蛋白水平又顯著低于實驗B組和實驗C組（P均<0.01）。見圖2。

2.3 重組質粒對乳腺癌細胞內VEGF-C蛋白表達的影響

各組乳腺癌細胞內VEGF-C蛋白表達情況見圖3～7。VEGF-C蛋白陽性可見胞漿內棕黃色顆粒。陰性對照組和空白對照組染色顏色均較深，為棕黃色，實驗A組、實驗B組和實驗C組染色均較陰性對照組和空白對照組淺，而又以實驗A組染色最淺。

3討論

VEGF-C是血管內皮生長因子家族成員，具有促進血管增生的作用，在腫瘤的生長和轉移過程中發揮重要的作用。而癌癥細胞分泌VEGF-C與其自身膜受體結合，能夠促進癌癥細胞的增殖，抑制癌細胞凋亡，降低癌細胞對化療藥物的敏感性。VEGF-C在乳腺癌細胞中呈高表達[5]。目前針對VEGF-C為靶點的治療主要有抑制VEGF-C受體的酪氨酸激酶活性、抗體封閉、降低VEGF-C及其受體的表達，但這些技術或方法均有一定的局限性。RNA干擾由雙鏈RNA介導的序列特異的同源基因經轉錄后發生的基因沉寂現象，其作用機制是小干擾RNA（siRNA）作為中介分子，與其他一些蛋白質構成沉默復合物，按照堿基互補規律，識別降解與siRNA同源的mRNA[6-8]。siRNA干擾是一種高效的、特異的基因表達抑制技術，廣泛用于基因治療相關的研究。該技術經人工合成靶向的siRNA，或者構建相應的載體，導入腫瘤細胞，能夠特異性抑制基因的表達。

1996年VEGF-C首次從前列腺腫瘤細胞中被分離出來，與VEGF家族其他成員具有同源性。VEGF-C在人類多種惡性腫瘤中均有高表達。VEGF-C在腫瘤組織中的高表達，結合腫瘤周圍組織淋巴管內皮細胞內VEGF-R3，誘發形成腫瘤相關淋巴管，增加淋巴管與腫瘤細胞的接觸，促進腫瘤細胞自淋巴管發生轉移[9，10]。表達VEGF-C的乳腺癌細胞更具有侵襲性，更容易經淋巴管轉移。正常的乳腺組織并不表達VEGF-C及VEGFR-3，而乳腺癌組織中會出現不同程度表達率，并且有淋巴結轉移者其表達高于無淋巴結轉者。研究顯示，腫瘤細胞分泌VEGF-C，特異性結合自身表面受體，促進腫瘤細胞的增殖，上調Bcl-2/Bax值，抑制癌細胞的凋亡，降低癌細胞的化療敏感性。目前針對VEGF-C及其受體的抗腫瘤治療方法有多種方式。目前已經發現，利用轉基因技術，使具有正常免疫力的小鼠MT-450乳腺癌模型中的乳腺癌細胞異位表達VEGFR-3-Ig，具有阻斷VEGF-C活性的效果，抑制局部轉移及肺轉移。抗纖維蛋白溶酶能夠抑制VEGF-C水解，阻止其不能結合VEGF-R3。這些基因靶向治療方法能夠發揮作用，但具有一定的局限性。

RNA干擾具有高效、高特異性的效果，采用該技術抑制VEGF-C的基因表達，為腫瘤治療提供了一種新的方法。siRNA為與目的基因同源的RNA，通常19～25個核苷酸長度，轉染靶細胞，與內切酶形成誘導沉默復合體，以siRNA為模板，識別并剪切、降解同源基因mRNA，形成瀑布效應，使細胞表現為目的基因缺陷表型。RNA干擾技術具有高效、特異、毒性小等優點，能夠高效抑制特定基因的表達，與反義核苷酸技術比較，具有更簡易、方便的特點[11，12]。

MCF-7乳腺癌細胞株屬于高表達VEGF-C細胞株，因此本次研究選擇此細胞株作為研究對象。siRNA的干擾作用具有劑量和時間依賴性，轉染后24～48 h，干擾效應逐漸明顯，48～72 h達到最高，因此本次實驗以轉染后48 h為檢測點[13，14]。RT-PCR是測定目的基因表達情況的常用方法，具有簡便、半定量的效果。VEGF-C/β-actin比值表示VEGF-C基因的相對表達量。本次研究中，陰性對照組及空白對照組VEGF-C基因表達相當，而實驗A組、實驗B組和實驗C組表達明顯降低，又以實驗A組的基因表達率最低。VEGF-C屬于分泌蛋白，對培養液上清液中VEGF-C水平的檢測采用ELISA法，以檢測乳腺癌細胞VEGF-C的分泌情況。結果顯示，實驗A組、實驗B組和實驗C組上清液中VEGF-C水平顯著低于空白對照組和陰性對照組，又以實驗A組水平最低。這兩個結果均提示RNA干擾后乳腺癌細胞VEGF-C基因表達及分泌水平顯著下降，又以pRNAT-VEGF-C-1質粒轉染的抑制作用最強。本次研究觀察各組細胞中VEGF-C蛋白表達水平，結果顯示細胞漿中可見呈棕黃色顆粒。陰性對照組和空白對照組染色較深，而RNA干擾后實驗A組、實驗B組和實驗C組染色程度均較陰性對照組和空白對照組淺，而以實驗A組的染色更淺。提示RAN干擾能夠抑制乳腺癌細胞VEGF-C蛋白的表達，尤其以pRNAT-VEGF-C-1質粒轉染的抑制作用最強。

綜上所述，靶向VEGF-C的siRNA表達載體可抑制人乳腺癌細胞VEGF-C基因、蛋白的表達，對蛋白分泌有抑制作用，而不同的質粒轉染效果也存在一些差異，以pRNAT-VEGF-C-1質粒的抑制效果最顯著。

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（收稿日期：2014-12-03）