鹽穗木HcDmc1基因的克隆和表達分析

杜 馳，張富春

（新疆大學 生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046）

植物生長過程中會因為溫度、紫外照射、高鹽等外界脅迫因素而產生DNA 損傷，并誘導許多DNA損傷修復基因表達［1］。DNA 損傷有多種形式，其中最嚴重的DNA 損傷形式是DNA 雙鏈斷裂（doublestand break，DSB），DSB損傷及時修復會導致染色體斷裂及細胞死亡［2］。DSB修復需要雙鏈斷裂修復基因的參與，而DNA 損傷修復基因Dmc1（disrupted meiotic cDNA）則發揮重要的作用。例如植物在外界脅迫下會出現減數分裂障礙，聯會復合體相關基因表達發生變化時，聯會復合體形成受阻［3］，這與DNA 損傷修復基因dmc1突變體的表型相似［4－5］。

研究發現，損傷修復蛋白Dmc1定位于第一次減數分裂前期Ⅰ的偶線期，是同源染色體配對和交叉重組所必需的［6］。Dmc1聚合到斷裂雙鏈中的單鏈DNA 3′末端尾巴上，結合非斷裂同源雙鏈DNA，通過同源重組幫助同源染色體聯會配對，參與雙鏈斷裂修復重組［7］。近年來，已從酵母、人、鼠、擬南芥等生物中克隆獲得Dmc1基因，人與酵母Dmc1基因功能相似［8］，Dmc1 缺失會阻止同系物之間的相互作用，dmc1突變體喪失重組功能；鼠Dmc1是減數分裂同源染色體聯會所必需的［9］；擬南芥dmc1突變體的同源染色體不能配對形成二價體［10］。這說明Dmc1是修復DNA 損傷斷裂，維持雙鏈正常復制、減數分裂的有序進行，抵御外界逆境脅迫，維持植物正常生長的重要調控因子。

鹽穗木（Halostachyscaspica）隸屬于藜科（Chenopodiaceae）鹽穗木屬（Halostachys），生長于干旱荒漠鹽堿地，對鹽分適應性極強，是新疆主要的鹽土荒漠植物之一，其莖、葉發育成肉質化同化枝，以減少水分的散失，成為典型的耐鹽植物［11－12］。根據實驗室以RNA－seq測序技術進行的鹽穗木鹽脅迫響應的轉錄組測序［13］分析，發現在鹽脅迫條件下，鹽穗木同化枝和根中DNA 損傷應激通路中相關基因表達差異明顯，提示DNA 損傷修復的相關基因可能與鹽脅迫具有密切相關性。本研究從鹽脅迫下轉錄組數據庫中，篩選到了DNA 損傷修復基因HcDmc1，并對其進行克隆和生物信息學分析，探討不同鹽濃度脅迫下鹽穗木DNA 損傷修復基因HcDmc1在不同時間點和不同組織的表達變化規律，為深入研究DNA 損傷修復基因HcDmc1在鹽穗木的耐鹽調控機理中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

鹽穗木種子采于五家渠103 團野外鹽堿地（87．31°E，44．29°N）。播種于鋪有基質（珍珠巖∶蛭石∶花土＝1∶1∶3，用雙子葉植物營養液拌濕）花盆中，在（24±2）℃，光照350μmol·m－2·s－1，晝／夜16h／8h，相對濕度為40%～60%條件下，并施以1／4 MS培養液培養120d左右。

1．2 鹽穗木的鹽脅迫處理

選取生長4個月左右的鹽穗木幼苗，置于100、300、500和700mmol／L NaCl溶液進行處理，處理前48～72h在托盤中加自來水去除干旱脅迫因素。待托盤中自來水吸凈無多余水分，將不同濃度NaCl溶液分別淋澆在基質上，直至溶液充滿基質淋出于托盤。將花盆置于處理前的培養環境，分別于各處理濃度下0、24和72h，以及7 和14d采樣。

1．3 總RNA 提取和cDNA 合成

稱量NaCl各脅迫處理后的鹽穗木根和同化枝各200 mg，分別用百泰克總RNA 提取試劑盒（RP3402，北京）提取總RNA，方法參照試劑盒說明書。用ND－2000 和15%變性PAGE 膠檢測RNA濃度和質量，每份3個重復。以1μg總RNA 為模板進行逆轉錄（20μL 反應體系），以Takara Oligo（dT）作為引物用M－MLV 反轉錄酶合成cDNA。反應程序：反轉錄反應液30℃靜置10min；移至42℃水浴鍋孵育60 min；70℃熱擊15 min；冰浴2 min。以此cDNA 為模板進行PCR 擴增。

1．4 HcDmc 1擴增

根據本課題組前期對鹽穗木轉錄組測序獲得的鹽穗木EST 序列，克隆并分析DNA 損傷修復基因（HcDmc1）開放閱讀框。設計上游引物（5′－CTCGTGGAATTCTCTCTCT TTCTCTATCTC－3′）和下游引物（5′－CCAGTAACTAGCTACATAATGCACGGTACTC－3′），以無脅迫處理狀態下的鹽穗木cDNA 為模板，擴增HcDmc1開放閱讀框。PCR 反應擴增參數為94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s；72℃延伸90s，30個循環；72℃延伸10min。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

按PCR 產物純化試劑盒（Omega）說明書進行PCR 產物回收?；厥盏钠闻cpEASY－T5載體（北京全式金公司）連接，操作按試劑盒說明書進行。連接產物轉化E．coliDH5α感受態細胞（北京全式金公司），酶切鑒定出陽性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1．5 序列分析

利用DNASTAR 軟件對已獲得的HcDmc1的核酸序列進行分析并推導其氨基酸序列；利用Prot－Param（http：／／web．expasy．org／protparam／）分析氨基酸序列的理化性；利用TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／）分析蛋白質的跨膜結構；利用Protscale（http：／／web．expasy．org／protscale／）分析蛋白質親疏水性；利用NCBI的保守結構域數據庫CDD（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／cdd／wrpsb．cgi？RID＝1K7GNVX3015＆mode＝all）分析預測氨基酸序列的保守結構域；利用PSORT ⅡPrediction（http：／／psort．hgc．jp／form2．html）和WoLF PSORT（http：／／wolfpsort．org／）預測蛋白質的亞細胞定位；利用TargetP（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TargetP／）分析蛋白潛在信號肽；利用NetPhos（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetPhos／）分析蛋白質磷酸化位點；利用MEGA 6．0 和DNAman軟件分析其同源性及構建系統發育樹。

1．6 鹽脅迫下HcDmc 1基因表達

根據HcDmc1的cDNA 序列設計qRT－PCR上游引物（5′－ACTCCTCGGCAATCTTCATCAAA－3′）和下游引物（5′－GAACGGTTTGGGATGGATGCT－3′），以Hcβ－Actin基因作為內參基因，設計上游引物（5′－CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA－3′）和下游引物（5′－TGAGACACACC ATCACCAGA－3′）。以NaCl各脅迫后鹽穗木的根和同化枝的cDNA為模板，取1．0μL cDNA，參照QIAGEN（Invitrogen公司）試劑盒說明書進行qRT－PCR，反應參數為：95℃預變性30s；95℃變性15s；58℃退火30s；72℃延伸40s（實時熒光信號采集）；40個循環。采用ABI PRISM 7500實時定量PCR 儀進行檢測，數據采用2－ΔΔCT法進行分析［14］。

2 結果與分析

2．1 鹽穗木Dmc 1基因的克隆及序列分析

圖1 HcDmc 1核酸序列及其氨基酸序列Fig．1 HcDmc 1nucleotide acid sequence and amino acid sequence

利用PCR 擴增獲得鹽穗木DNA 雙鏈斷裂鉸鏈蛋白基因HcDmc1，開放閱讀框為1 035bp，編碼344個氨基酸（圖1）。通過NCBI保守結構域數據庫，分析HcDmc1的保守結構域，結果顯示該蛋白含有2個超家族，H3TH（helix－3－turn－helix）和ABC－ATPase超家族。H 3TH超家族是一個帶正電的DNA 活性位點，結合5′核酸酶，主要包含了FEN1（Flap Endonuclease－1）、EXO1（Exonuclease－1）、Mkt1、GEN1（Gap Endonuclease 1）、XPG（Xeroderma pigmentosum complementation group G）等核酸內切酶，參與DNA 復制、修復、重組。而ABC－ATPase超家族，有ATP 運輸核苷酸的結合位點和核苷酸水解酶ABC 轉運蛋白，包含2 個DNA結合域loop1 和loop2，2 個嘌呤核苷酸結合位點（motif A and B），說明HcDmc1可能具有通過這2個結構域發揮運輸核苷酸參與DNA 損傷修復的功能。

圖2顯示，鹽穗木Dmc1氨基酸序列與馬鈴薯、番茄、山柳菊、黃瓜等的氨基酸序列相似性較高。運用MEGA 6．0軟件對18種植物的Dmc1氨基酸序列構建系統進化樹（圖2），結果表明鹽穗木Dmc1為獨立的一枝。

2．2 HcDmc1蛋白的結構特征、功能分析

通 過ExPASy ProtParam 預測HcDmc1基因編碼的氨基酸序列的組成和理化性質。該基因編碼344個氨基酸，其編碼蛋白相對分子量為37 694．2 Da，理論等電點為5．46，酸性氨基酸殘基總數（Asp＋Glu）為40個，堿性氨基酸殘基總數（Arg＋Lys）為47個，原子總數是5 339，分子式為C1669H2693N455O509S13，疏水性平均值GRAVY（（Grand average of hydropathicity）為－0．125，表明其為親水性蛋白。該蛋白質不穩定指數是31．72，為穩定的蛋白。應用Psort、WoLF PSORT 兩種工具預測該蛋白的亞細胞定位，該蛋白定位于細胞質、細胞核、線粒體、葉綠體、細胞骨架和過氧化物酶體。兩種預測軟件結果一致，推測該蛋白定位于細胞質的概率較高，同時線粒體、葉綠體中也有所分布。結合Signal P 4．0 Server軟件對信號肽的預測結果顯示，HcDmc1的N 端至第70位氨基酸之間信號肽分值和綜合剪切分值D＝0．101＜D－cutoff＝0．450，沒有明顯峰值，推測HcDmc1編碼的蛋白不存在信號肽。通過Expasy軟件中的TMHMM Server v．2．0工具預測，HcDmc1氨基酸序列中不存在跨膜螺旋區，344 個氨基酸殘基全部在膜外，為非跨膜蛋白。

2．3 HcDmc1的磷酸化位點和活性位點的分析

磷酸化是生物體內一種普遍的調節方式，在細胞信號轉導和蛋白調控過程中起著重要的作用。磷酸化位點分析表明，HcDmc1有5個絲氨酸、3個蘇氨酸、3個酪氨酸磷酸化位點。利用NPS（Network Protein Sequence Analysis）的Prosite Scan對Hc－Dmc1進行活性位點分析，結果（表1）顯示，HcDmc1 有7 類活性位點，分別是N－糖基化位點、cAMP－和cGMP－依賴性蛋白激酶磷酸化位點、蛋白酶C磷酸化位點、酪蛋白酶Ⅱ磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點、N－十四?；稽c、酰胺化位點、ATP／GTP－結合位點。這是HcDmc 1發揮其催化作用所必須的。

圖2 不同植物基于Dmc1氨基酸序列的系統進化樹Fig．2 Phylogenetic tree of different plants based on amino acid of Dmc1

2．4 鹽脅迫下HcDmc 1基因的表達分析

采用qRT－PCR方法，以β－actin作為內參，分別檢測不同濃度鹽脅迫下鹽穗木根和同化枝HcDmc1轉錄水平變化（圖3）。首先以HcDmc1和Hcβ－Actin實時定量引物建立標準曲線，HcDmc1熔解曲線所得的TM 值為（82．77±0．1）℃，峰值單一，沒有引物二聚體和非特異性條帶。在8個10n倍系列稀釋條件下得到的標準曲線方程為y＝－3．295x＋29．772，相關系數（R2）為0．995，擴增效率（Efficiency）為101．132。經過擴增條件、程序的優化，HcDmc1擴增效率達到了相對定量公式2－△△CT 的使用標準，進而繼續進行相對定量實驗。

表1 HcDmc1在NPS中的活性位點預測分析Table 1 Scanning of HcDmc1for site／signatures against proscan database in NPS

圖3 鹽穗木根（A）和同化枝（B）中HcDmc1相對表達Fig．3 Relative expression of HcDmc1response to salt－stress in root（A）and branch（B）

相對定量計算結果表明，300mmol／L NaCl脅迫處理后，HcDmc1 在根中的表達明顯上調。在100mmol／L NaCl脅迫下，根中HcDmc1表達無明顯變化，但在300mmol／L NaCl脅迫24h后表達顯著上升，約為處理0h的鹽穗木組織的1．66倍，在500和700mmol／L NaCl脅迫下，均為脅迫14d達到最高，約為0h的1．63和1．79倍（圖3，A）。

而同化枝中HcDmc1的表達量在100mmol／L NaCl脅迫24h后開始劇增，在脅迫7d時達到最高，約為0h 的6．58 倍（圖3，B）。在500 和700 mmol／L NaCl脅迫下，表達略有下降，但仍然維持在較高水平。

3 討 論

減數分裂是植物有性生殖的重要過程，也是遺傳信息傳遞的基本方式。正常狀況下，第一次減數分裂前期的粗線期的染色體是二價體形態，然而擬南芥dmc1突變體中染色體以單體狀態存在，說明AtDmc1基因對減數分裂交叉結的形成是必需的，維持染色體正常配對和聯會［15］。此外，Dmc1蛋白作為大腸桿菌RecA 蛋白的同源蛋白［16］，能夠聚合到斷裂的單鏈DNA 上，形成核蛋白纖維［17］，通過非同源末端連接途徑參與聯會復合體配對，重組修復斷裂的雙鏈［18］。

對Dmc1基因編碼氨基酸序列分析發現其在植物中具有較高的相似性（80% 以上），說明植物Dmc1的氨基酸序列在進化上是高度保守的，其編碼的氨基酸序列長度和順序變異較小，其特定基序對于Dmc1蛋白發揮活性結合雙鏈、單鏈DNA 具有重要作用，尤其是基序GEFRSGKT 是ATPbinding結合位點，廣泛存在于Dmc1及其同源蛋白Rad51和DNA 重組修復蛋白RecA、RadA 中［19］。對HcDmc1 磷酸化位點和活性位點的分析可知蛋白激酶可能參與了HcDmc1活性功能調節，而蛋白激酶是植物抵御逆境脅迫信號傳導鏈的重要組分，HcDmc1在減數分裂中的作用可能受到了特定信號調節，并參與到植物抗逆途徑中。對HcDmc1蛋白進行信號肽預測、跨膜結構域預測、疏水性／親水性分析和亞細胞定位都顯示該蛋白主要存在于細胞質，不與細胞膜結合，是穩定的親水性蛋白，這與動物中Dmc1基因序列的分析結果相同［20］。

已有研究表明，植物在外界非生物脅迫下，DNA 會造成不同程度損傷變異，甚至斷裂，同源重組和聯會復合體是影響減數分裂的發生和配子的形成的主要因素［21－23］。Deng［24］對水稻的Dmc1基因進行RNAi干擾之后發現其具有同源配對缺陷，不能形成二價體，同時出現花粉不育現象，McHale等［25］研究發現，在兩種顯著不同溫度環境中，相同基因型的馬鈴薯（Solanumtuberosum）產生未減數配子的頻率相差很大。這說明，DNA 損傷修復基因Dmc1在逆境下具有保持染色體完整，減數分裂中染色體正常配對，同時修復斷裂的雙鏈的功能。本研究發現，鹽穗木減數分裂同源重組蛋白基因Hc Dmc1受鹽脅迫誘導表達，尤其是在其繁殖器官同化枝中表達量顯著升高，推測其可能是鹽穗木通過高表達HcDmc1蛋白，對高鹽脅迫造成的斷裂缺口的DNA 單鏈進行同源依賴性修復，以緩沖重組而導致的新型遺傳表現，提高鹽穗木鹽脅迫環境適應性和生殖生長能力。

目前關于Dmc1基因表達模式研究的較少，本研究與擬南芥Dmc1和水稻Dmc1基因的表達分析結果相似，表現為在生殖器官中表達活性最高，在葉和根中表達量略低［26］。通過對HcDmc1在鹽穗木鹽脅迫下不同組織表達定量分析，發現隨著鹽濃度和脅迫時間的增加，鹽穗木根中表達量升高，暗示HcDmc1在根中可能后期響應鹽脅迫。而在同化枝中的響應明顯提前于根，說明鹽穗木同化枝中Hc－Dmc1對鹽脅迫更為敏感，并在長時間高鹽脅迫下維持較高的表達水平，以保證繁殖器官減數分裂、復制等生命周期的正確性，進而確保鹽脅迫下物種的穩定遺傳。

本研究對從鹽穗木中克隆獲得的HcDmc1 基因進行了生物信息學分析，探討了HcDmc1響應鹽脅迫基因的表達變化規律，證明了HcDmc1能夠參與鹽穗木鹽脅迫應答過程。而HcDmc1 在鹽穗木緩解鹽脅迫過程中如何形成聯會復合體和參與減數分裂重組，有待深入研究。鹽穗木HcDmc1基因的克隆和鹽脅迫下不同組織的表達分析，有助于闡明DNA 損傷修復在鹽穗木耐鹽調控機理中的作用。

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