miR-145對NSCLC細胞增殖和FSCN1蛋白表達的影響研究

牟志民,毛廣顯,謝遠財,彭旭興,烏達

(北京大學深圳醫院 胸外科，廣東 深圳 518036)

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miR-145對NSCLC細胞增殖和FSCN1蛋白表達的影響研究

牟志民,毛廣顯,謝遠財△,彭旭興,烏達

(北京大學深圳醫院 胸外科，廣東 深圳 518036)

目的 研究miR-145在人非小細胞肺癌細胞 A549中的表達及其對A549細胞增殖和靶蛋白 FSCN1表達的影響。方法 采用分子克隆實驗構建pmR-mcherry/miR-145真核表達載體，瞬時轉染 A549細胞，QPCR法檢測miR-145在細胞中的表達水平；Western blot 檢測miR-145對細胞中FSCN1蛋白表達水平的影響；細胞增殖實驗檢測miR-145對A549細胞增殖能力的影響。結果 成功構建pmR-mcherry/miR-145真核表達載體，轉染A549細胞后QPCR檢測其可有效表達；Western blot結果顯示過表達miR-145后，FSCN1的蛋白水平明顯的下調；細胞增殖實驗結果顯示miR-145能明顯抑制肺癌細胞A549的增殖。結論 過表達miR-145可抑制A549細胞增殖并下調FSCN1基因的表達水平。

miR-145；FSCN1；細胞增殖

肺癌居全球癌癥病死率之首，非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的類型。研究表明肺癌5年生存率的表現仍然不佳[1]。miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，其功能是靶向基因編碼的mRNA并調節mRNA的翻譯和/或降解[2]。大量研究表明，miRNAs參與許多細胞活動的調節如物質代謝、細胞增殖、細胞凋亡以及腫瘤細胞的發生、發展和分化[3-4]。miR-145是重要的抑癌分子，已知其在多種類型的惡性腫瘤中表達異常下調，包括前列腺癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌以及B細胞惡性腫瘤等。有報道證明miR-145的過表達具有生長抑制作用[5]。研究顯示miR-145可通過誘導p53表達、靶向c-myc和IRS-1來抑制細胞的生長，同時具有靶向ADAM17、MUC1、Oct4和FSCN1等，抑制胚胎干細胞、癌癥干細胞的增殖并調節其遷移和侵襲的多能性[6]。研究表明在臨床樣本中fascinhomolog1 基因(FSCN1)與 miR-145的表達水平呈負相關[7]。本實驗旨在構建 miR-145真核表達載體，轉染A549細胞，檢測其在細胞中的表達及對肺癌細胞增殖和FSCN1)表達的影響，以期闡明miR-145在肺癌發生中的作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 A549細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。

T4 DNA連接酶、感受態大腸桿菌DH5α(美國Promega公司)；限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP(日本Takara公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、RIPA裂解液(東盛生物技術有限公司)；脂質體LipofectamineTM2000、Trizol(美國Invitrogen公司)；pmR-mcherry質粒(本院醫學研究中心保存)；RPMI-1640培養液和胎牛血清(美國Hyclone公司)。FSCN1抗體及二抗均為英國Abcam公司產品；SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)。

PRISM?7500定量PCR儀(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 miR-145真核表達載體的構建:由miRBase網站查詢獲得hsa-miR-145前體序列(M10000461)，通過BLAST比對獲取其基因組序列，引物設計軟件primer5設計引物。引物由上海life公司合成。primer1：5’-CGgaattcGGCTGGATGCAGAAGAG-AAC-3’，primer2：5’-GCggtaaccGCCTTCTTCTTGAACCCTCA-3’。primer1中為EcoR I酶切位點，primer2中為Kpn l酶切位點。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30s，72 ℃延伸50 s，進行30個循環后，72 ℃延伸5 min。將PCR產物及pmR-mcherry質粒分別用EcoR I和Kpn l進行雙酶切，用T4連接酶將酶切回收的產物16 ℃連接過夜，次日轉化至DH5α大腸桿菌感受態中，挑選陽性克隆并進行雙酶切鑒定后送測序驗證。

1.2.2 細胞培養及轉染：A549細胞用RPMI1640培養液+10%胎牛血清中于37 ℃，5%CO2及一定濕度下進行常規培養，細胞密度為105個/mL，每孔2 mL細胞懸液。待6孔板中的細胞生長密度達70%～80%時，用lipofectamine轉染試劑盒分別將pmR-mcherry/miR-145、pmR-mcherry空載體轉染至A549細胞，具體步驟參照轉染試劑盒說明書。每孔質粒量為0.5 ug，終濃度為150 nmol/L。

1.2.3 定量PCR檢測miR-145在A549細胞中的表達：轉染pmR-mcherry/miR-145過表達載體24 h后，提取細胞總RNA，oligo dT法反轉錄后進行定量PCR檢測。miR-145莖環引物為：上游5’-acactccagctgggtttgggagtct-3’，下游5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。U6基因為內參：上游5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，下游5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。PCR擴增條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共40個循環。每個樣重復3次。

1.2.4 Western blot檢測FSCN1蛋白表達：收集轉染miR-145 72 h的A549細胞；RIPA裂解液裂解細胞得到總蛋白；BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳；5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；TBST洗10 min，重復3次，然后加1∶1000稀釋的一抗(Abcam，英國)室溫孵育1 h；TBST洗10 min，3次，加1:4000稀釋的二抗(Abcam，英國)，室溫孵育1 h；TBST洗10 min，3次；BCL顯影，曝光。

1.2.5 miR-145對A549細胞增殖能力的影響：分別收集轉染0、24、48、72、96 h后的A549細胞，進行細胞生長曲線測定。在0.08 mL臺盼藍(含0.1% Trypan blue的PBS)中加0.2 mL細胞懸液，立即用微量巴氏吸管混勻后，吸足量細胞懸液從血細胞計數室的一邊加樣；使用Freshney計數板計算細胞數。

2 結果

2.1 載體構建 pmR-mcherry/miR-145載體構建結果見圖1。PCR特異擴增出的miR-145前體片段條帶和目標條帶大小及位置一致(line 1)。重組質粒經限制性內切酶KpnⅠ和EωRI雙酶切，可獲得約4500 bp和200 bp的條帶(line 2)，說明miR-145前體片段已成功連接至cherry空質粒中；測序結果與GeneBank中的miR-145前體序列一致，表明重組質粒pmR-mcherry/miR-145構建成功(結果未顯示)。

圖1 pmR-mcherry/miR-145載體構建電泳結果M：DL 500 bp Marker；1：miR-145前體片段PCR產物；2：pmR-mcherry/miR-145雙酶切產物Fig.1 Electrophoresis results of recombinant plasmid pmR-mcherry/miR-145M:DL 500 bp Marker; 1.PCR product of miR-145 precursor;2.Restrictive enzyme digestion products of pmR-mcherry/miR-145

2.2 miR-145表達水平檢測 QPCR法檢測pmR-mcherry/miR-145重組質粒轉染A549細胞24 h后miR-145的表達結果見圖2。轉染重組質粒A549的細胞miR-145的表達量遠高于轉染空質粒組(P<0.01)，說明miR-145在A549細胞中得到過表達，可以用于后續檢測實驗。

圖2 miR-145的相對表達量Fig.2 Relative expression of miR-145

2.3 miR-145對FSCN1蛋白水平的影響 采用Western blot檢測過表達miR-145對FSCN1蛋白表達的影響。結果顯示：重組質粒組中FSCN1的表達量明顯低于空質粒組和空白對照組(均P<0.05)；空質粒組中FSCN1的表達量與空白對照組無明顯差別。說明過表達miR-145后，FSCN1蛋白水平的表達出現明顯下調，見圖3。

圖3 Westernblot檢測FSCN1蛋白表達水平Fig.3 Relative expression of FSCN1 protein

2.4 過表達miR-145對A549細胞增殖能力的影響 細胞增殖實驗結果顯示，A549細胞轉染miR-145重組質粒72 h后，miR-145重組質粒組對A549細胞增殖的抑制明顯強于對照組(P<0.05)，在96 h抑制作用更為明顯(P<0.05)，見圖4。說明miR-145可能通過下調FSCN1的表達水平來抑制肺癌細胞A549的增殖。

圖4 過表達miR-145對A549細胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of miR-145 overexpression on A549 cell proliferation

3 討論

肺癌是發病率最高的惡性腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面有很大的進步，但其仍是癌癥死亡的主要原因，肺癌中近85%的患者為非小細胞肺癌[8]。FSCN1是一種將細胞內F-肌動蛋白組織成有序的，緊密的平行束的分子量為55 kDa的球狀蛋白[9]。脊椎動物基因組中存在3種形式的FSCN：FSCN1，在間充質組織和神經系統中廣泛表達； FSCN2，由視網膜感光細胞表達；FSCN3，具有睪丸特異性。FSCN1為負責介導細胞間相互作用和細胞內運動的細胞質微絲束。最近研究表明，在腫瘤患者身體的許多部位中均檢測到FSCN為1蛋白的上調[10]。在非小細胞肺癌和胃腺癌的研究顯示，帶瘤生存率較差與腫瘤中FSCN1的高表達相關[11-13]。

本實驗通過構建pmR-mcherry/miR-145真核表達載體，瞬時轉染 A549細胞，發現過表達miR-145后，FSCN1的蛋白水平明顯的下調；細胞增殖實驗結果顯示miR-145能明顯抑制肺癌細胞A549的增殖。表明miR-145抑制A549細胞的增殖很可能是通過調節A549細胞中FSCN1蛋白的表達水平實現的。在后續實驗中將進一步探討miR-145在肺癌細胞侵襲轉移中的作用，以期為肺癌的臨床診斷和生物治療提供理論依據。

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(編校：吳茜)

Effect of miR-145 on NSCLC cell proliferation and FSCN1 protein expression

MU Zhi-min,MAO Guang-xian,XIE Yuan-cai△,PENG Xu-xing,WU Da

(Department of Thoracic Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-145 on human lung adenocarcinaoma A549 cell proliferation and FSCN1 expression.MethodspmR-mcherry/miR-145 was constructed and transfected into A549 cell，then the expression of miR-145 and the proliferation of A549 cell were verified by QPCR and MTS assay, respectively．The situation of FSCN1 expression in A549 cell was detected by Western blot.ResultspmR-mcherry/miR-145 vector was constructed successfully，and QPCR results indicated that miR-145 expressed effectively.Western blot results showed that FSCN1 was one of the targets of miR-145 in A549 cell．MTS assay results indicated that miR-145 inhibited the proliferation of A549 cell.ConclusionOverexpression of miR-145 can inhibit the proliferation of A549 cell, and FSCN1 was one of its target.

miR-145;fascinhomolog1;cell proliferation

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140415162338820);深圳市醫療衛生科研項目(201302068)

牟志民，男，學士，副主任醫師，研究方向:胸外科，E-mail：szmzm416@126.com；謝遠財，男，通訊作者，博士，主任醫師，研究方向：胸外科疾病，E-mail：xieyuancai2005@126.com。

R734.2

D

1005-1678(2015)03-0025-03