二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達影響的研究

李賓,張卉,張輝

(1.河南黃淮學院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學院 護理學系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

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二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達影響的研究

李賓1,張卉2,張輝3

(1.河南黃淮學院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學院 護理學系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

目的 分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的作用，并探討二磷酸鹽對小鼠骨癌痛模型的干預機制。方法 60只小鼠隨機分為3組：對照組、模型組和治療組。股骨遠端骨髓腔注射NCTC2742細胞復制小鼠股骨痛模型，治療組給予二磷酸鹽治療，對照組和模型組給予等量生理鹽水。Real-time PCR分析各組中趨化因子CXCL1和CXCR2mRNA的表達，Western blot檢測CXCL1、CXCR2蛋白及腫瘤壞死因子TNF-α以及細胞凋亡蛋白Bax/Bcl2以及Caspase-3的表達。結果 模型組小鼠的機械縮爪閾值較對照組有顯著的增高(P<0.05，P<0.01)，而藥物治療組對模型組小鼠的升高的閾值有顯著的改善作用(P<0.01)；與對照組比較，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達明顯增強(P<0.01)，二磷酸鹽可以顯著抑制CXCL1及CXCR2的表達(P<0.01)；與對照組比較，骨癌痛模型小鼠腫瘤壞死因子TNF-α、促細胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表達明顯增高，凋亡蛋白Bcl2的表達明顯降低(P<0.01)，而二磷酸鹽可以顯著改善上述指標表達(P<0.01)。結論 二磷酸鹽通過下調骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達、促進細胞凋亡發揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

二磷酸鹽；骨癌痛；趨化因子；細胞凋亡；受體

骨癌是發生于骨骼及其附屬組織的惡性腫瘤，臨床上進展迅速、預后不佳、死亡率高[1-3]。骨癌臨床上表現為功能障礙、腫脹或腫塊以及壓迫癥狀，但其早期出現的主要癥狀為疼痛[4-5]。但是，目前對骨癌的發病機制尚未完全闡明。臨床上治療骨癌主要采用手術切除、化療及放療方法。本研究采用股骨遠端骨髓腔注射NCTC2742細胞復制小鼠股骨痛模型，分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的參與作用，并探討二磷酸鹽對小鼠骨癌通模型的干預機制。同時研究也分析了TNF-α及細胞凋亡的參與機制，以期為臨床相關治療機研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 實驗用昆明小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心[合格證號SZXK(上)20080033]，體質量22～25 g。小鼠于(22±2)℃、濕度(50±5)%適應性飼養1周，自由飲水。60只小鼠隨機分為3組：對照組、模型組和治療組(n=20)。所有操作均符合《實驗動物保護條例》。

1.2 儀器與試劑 mRNA提取及逆轉錄試劑盒：大連寶生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq：大連寶生物工程有限公司；熒光定量PCR儀：ABI7700，美國ABI公司；引物合成：上海生工生物有限公司；脫脂奶粉：內蒙古伊利乳業有限公司；HRP標記的羊抗小鼠/羊抗兔的二抗：北京中杉金橋生物技術有限公司；一抗購自美國Santa Cruz公司和Abcam公司(詳見1.5)； PVDF膜：美國Amersham公司；電泳槽、電泳儀及蛋白轉移系統：美國ABI公司；戊巴比妥鈉購自國藥集團化學試劑有限公司(批號20130906)；凝膠成像系統購自美國UVP公司。

1.3 骨癌通模型復制 骨癌通模型復制參照馬正良等[6]報道的方法：小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后行右膝關節切開術，并將NCTC細胞(約2×105個)注入股骨遠端骨髓腔中，然后將傷口用手術線縫合后于適宜環境下飼養。對照組僅接種MEM培養基。按照文獻[6]的方法分析各組動物的機械縮爪閾值。實驗結束后取各組小鼠右側股骨標本于液氮中保存。

1.4 Real-time PCR檢測趨化因子CXCL1和CXCR2 mRNA的表達 mRNA的提取及純化按照說明書進行。Real-time PCR的擴增體系：2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。PCR擴增的反應條件為：95 ℃10 s，60 ℃40 s，共28個循環。采用熔解曲線鑒定qRT-PCR產物，并用公式(ΔCt)進行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct。引物由大連寶生物合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time PCR

1.5 Western blot檢測CXCL1、CXCR2、TNF-α、Bax/Bcl2及Caspase-3蛋白表達 各組動物股骨標本組織充分勻漿，總蛋白提取嚴格按照說明書操作(蛋白提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。考馬斯亮藍法蛋白定量后以等量蛋白進行SDS-PAGE和半干法轉膜。轉至硝酸纖維素膜上后5%脫脂牛奶封閉2h。然后與一抗[CXCL1一抗購自美國Abcam公司(工作濃度1:300)；CXCR2蛋白一抗購自美國Santa Cruz公司(工作濃度1:500)；TNF-α(工作濃度1:400)、Bax(工作濃度1:500)/Bcl2(工作濃度1:200)及Caspase-3(工作濃度1:300)均購自美國Abcam公司]溫孵過夜，PBS漂洗3次后與HRP標記二抗(1:200)室溫反應1 h漂洗后ECL混合液顯色、曝光、顯影、定影，用凝膠成像分析系統測定光密度，以β-actin作為參照，進行蛋白表達的定量分析。

2 結果

2.1 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠機械縮爪闕值影響的分析 本研究發現，模型組小鼠的機械縮爪閾值較對照組有顯著的增高(P<0.05，P<0.01)，而藥物治療組對模型組小鼠的升高的閾值有顯著的改善作用(P<0.05)，見圖1。

圖1 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠機械縮爪闕值影響的分析#P<0.05，##P<0.01，與對照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig．1 The effect of diphosphate on cancer pain threshold in bone pain model and drug interventions#P<0.05，##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.2 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠CXCL1表達的影響 本研究發現，與對照組比較，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1的表達明顯增高(P<0.01)，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調的CXCL1的表達(P<0.01)，見圖2。

圖2 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠CXCL1表達的影響的分析##P<0.01，與對照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.2 The increased expression of CXCL1 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.3 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠 CXCR2受體表達的影響 本研究發現，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCR2的表達明顯增高(P<0.01)，且與對照組有顯著的統計學差異性，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調的CXCR2的表達(P<0.01)，見圖3。

圖3 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠CXCR2表達的影響的分析##P<0.01，與對照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.3 The increased expression of CXCR2 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.4 TNF-α表達分析及二磷酸鹽干預作用 本研究發現，骨癌痛模型小鼠腫瘤壞死因子TNF-α的表達明顯增高(P<0.01)，且與對照組有顯著的統計學差異性，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調的TNF-α的表達(P<0.01)，見圖4。

圖4 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠TNF-α表達的影響的分析##P<0.01，與對照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.4 The increased expression of TNF-α in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.5 細胞凋亡相關蛋白表達及藥物干預作用 本研究發現，骨癌痛模型小鼠促細胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表達明顯增高，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達明顯降低(P<0.01)，且與對照組有顯著的統計學差異性，而二磷酸鹽可以顯著改善上述蛋白的異常表達(P<0.01)，見圖5。

圖5 二磷酸鹽對骨癌痛模型小鼠細胞凋亡相關蛋白表達的影響的分析##P<0.01，與對照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.5 The increased expression of Bax and Caspase-3 as well as decreased expression of Bcl2 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

3 討論

骨癌是臨床上常見的腫瘤之一，進展迅速，其發病率和死亡率有逐年升高的趨勢。骨癌有原發性骨癌和繼發性骨癌。如臨床上前列腺癌患者容易發生骨轉移，嚴重影響患者的生活質量。目前，骨癌模型通常采用跟骨、脛骨等建立模型，股骨由于骨髓腔較大，容易操作[7-9]，因此本研究采用股骨建立骨癌模型，分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的參與作用。研究發現，模型組小鼠CXCL1及受體CXCR2表達明顯增強，同時TNF-α以及促細胞凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達下調，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達上調。二磷酸鹽治療組上述蛋白的異常表達得到部分恢復。因此，二磷酸鹽通過下調骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達、促進細胞凋亡發揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

骨癌痛是臨床上骨癌早期最主要的癥狀之一，早期癥狀較輕，而隨著病情的加重疼痛度逐漸增加。骨癌痛發展多為持續性發病，在夜間疼痛容易加劇。已有的研究證實，趨化因子及其受體在疼痛的發生及加劇過程中有廣泛的參與性，如CCL2/CCR2、CXCL1/CXCR2、CX3CL1/CR1[10-11]。研究證實，骨癌痛患者CCL2與脊髓膠質細胞活化密切相關，且參與了骨癌痛的發生及發展過程[12]。在研究大鼠足底炎性疼痛的研究中也證實，趨化因子IP-10參與完全弗氏佐劑誘導的足底炎癥疼痛，而且JNK激酶能夠調控佐劑誘導的疼痛和IP-10的表達[13]。以往研究也證實，炎性疼痛中模型中單核細胞趨化因子及其受體信號通路通過增強模型中外周DRG痛覺神經元的興奮性發揮 調節疼痛病理過程的作用[14]。同時，姜黃素通過下調大鼠脊髓背角和背根節CXCR1的表達緩解神經病理性疼痛[15]。本研究中也證實，小鼠骨癌痛模型組中趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達明顯增強，而二磷酸鹽可以顯著下調其表達，提示其可能是通過抑制趨化因子的上調表達緩解NCTC細胞誘導的骨癌痛。

細胞凋亡是細胞的程序化死亡過程，廣泛參與了多種病理過程的發展及發展，是由多種促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白所調節的。研究證實，蛇毒復方制劑能夠顯著下調W256細胞誘導的骨癌痛大鼠組織破骨細胞數量，并促進其細胞凋亡過程，上調骨組織中骨保保護素的表達，發揮對破骨細胞數量和活性的保護作用[16]。同時，在骨癌痛大鼠的鎮痛效應研究中也發現，Caspase-3基本的過表達可以誘導神經細胞和非神經細胞的凋亡，而不依賴于外源或上游信號刺激，進而緩解骨癌痛的發展[17]。本研究中也證實，腫瘤壞死因子TNF-α以及細胞凋亡蛋白Bax以及Caspase-3的表達在模型組明顯下調，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達卻明顯下調，而二磷酸鹽可以顯著改善細胞凋亡蛋白的異常表達，表明細胞凋亡過程參與了NCTC細胞誘導的骨癌痛過程，二磷酸鹽主要通過調節趨化因子表達進而促進組織中細胞凋亡過程的發生而發揮緩解骨癌痛模型小鼠的作用。

因此，二磷酸鹽通過下調骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達、促進細胞凋亡發揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

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(編校：王儼儼)

Effect of diphosphate on expression of CXCL1 and its receptor CXCR2 in bone cancer pain mice

LI Bin1,ZHANG Hui2,ZHANG Hui3

(1.College of Biological Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000; 2.The Henan huanghuai College Nursing Department of Zhumadian 463000; 3.Department of Urinary Surgery, Zhumadian City Center Hospital, Zhumadian 463000)

ObjectiveTo explore the involvement of CXCL1 and CXCR2 in the pathogenesis of bone cancer pain and the interventions of diphophated.Methods60 mice were divided into 3 groups randomly: control, model and diphosphated group.The bone cancer pain mice were duplicated by injection of NCTC742 cell while control mice were received same dose of NS.Diphosphate group mice were received diphosphate while control group were received same dose of NS.The expressions of CXCL1, CXCR2, TNF-α and apoptosis proteins were detected by Real-time PCR and Western blot.ResultsThe cancer pain threshold in bone pain model were higher than that of control group (P<0.05,P<0.01), while cancer pain threshold in diphosphated group was improved(P<0.01).Compared with control group, the expression of chemotactic factor CXCL1 and its receptor of CXCR2 in model group were up-regulated(P<0.01), while the expression of those parameters were improved(P<0.01).The expression of TNF-α, Bax as well as Caspase-3 were up-regulated and Bcl2 was down-regulated in model group(P<0.01), while diphosphate normalized those parameters with a statistical difference(P<0.01). ConclusionDiphosphate alleviates the bone cancer pain by inhibiting the enhanced CXCL1 and its receptor CXCR2 as well as promoting apoptosis.

diphosphate; bone cancer pain; chemotactic factor; apoptosis; receptor

黃淮學院青年骨干教師資助計劃，河南省教育廳科技攻關項目(14B180006)

李賓，男，碩士，講師，研究方向：分子生物學、生物化學，E-mail：binlyyy@163.com。

R927.1

A

1005-1678(2015)02-0031-04