甾體激素受體輔激活子-2對子宮內(nèi)膜異位癥患者孕酮抵抗的作用研究

常玉華,劉香環(huán),李坤

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031)

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甾體激素受體輔激活子-2對子宮內(nèi)膜異位癥患者孕酮抵抗的作用研究

常玉華1,劉香環(huán)1,李坤2

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031)

目的 通過檢測子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)患者異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中孕酮受體(progesterone receptor，PR)和甾體激素受體輔激活子-2(steroid receptor coactivator-2，SRC-2)的表達(dá)，探討SRC-2對EMs患者孕酮抵抗的作用。方法 隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間在山東省交通醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡或開腹手術(shù)的EMs患者45例(異位內(nèi)膜組)和35例因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)患者非瘤區(qū)對照子宮內(nèi)膜組織(對照內(nèi)膜組)。采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和免疫組化檢測異位內(nèi)膜組和對照內(nèi)膜組中PR和SRC-2的表達(dá)，并進(jìn)行比較。結(jié)果 PR和SRC-2在異位內(nèi)膜組中的表達(dá)顯著低于對照內(nèi)膜組(P<0.05)；對照內(nèi)膜組中PR和SRC-2的表達(dá)在增生期增強(qiáng)，并隨著分泌期逐漸減弱，在整個(gè)月經(jīng)周期中存在周期性變化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；異位內(nèi)膜組中PR和SRC-2的表達(dá)在增殖期和分泌期比較，無周期性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 SRC-2可以調(diào)控PR基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，其表達(dá)下降可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)改變，從而顯著消減子宮PR對孕酮的反應(yīng)性。

子宮內(nèi)膜異位癥；甾體激素受體輔激活子-2；孕酮受體；孕酮抵抗

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡期的婦女常見的多發(fā)病。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，育齡期婦女患EMs的比例已經(jīng)高達(dá)6%～10%[1]。而對于那些患有慢性盆腔痛或是不孕癥的育齡婦女，其患EMs的比例更是高達(dá)45%～50%[2]。異位內(nèi)膜周期性出血形成的病灶會(huì)導(dǎo)致育齡期女性不孕及嚴(yán)重的慢性疼痛[3]。孕酮是拮抗雌二醇(estradiol，E2)的經(jīng)典藥物，其可通過與受體結(jié)合介導(dǎo)信號傳導(dǎo)從而調(diào)控基因表達(dá)，抑制異位內(nèi)膜的生長和炎性反應(yīng)[4]。很多孕酮類藥物在臨床上用來緩解和控制EMs患者的癥狀。然而，雖然EMs患者的血清孕酮水平正常，但是其整個(gè)生殖系統(tǒng)對孕酮的反應(yīng)性失調(diào)，表現(xiàn)為EMs患者對孕酮治療呈現(xiàn)低反應(yīng)和無反應(yīng)，這一現(xiàn)象被稱為“孕酮抵抗”[5]。目前國內(nèi)外的研究表明，孕酮抵抗可能與甾體激素受體輔激活子(steroid receptor coactivator，SRC)等有關(guān)[6]。通常這些受體輔激活子蛋白以配體依賴性的形式與雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)結(jié)合，從而激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)[7]。近年來更多的研究表明[8]，SRC-2在調(diào)節(jié)PR功能上發(fā)揮著十分重要的作用。SRC-2是轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控)之間的“橋梁”蛋白，以多蛋白復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并最終促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄和相關(guān)蛋白的表達(dá)[9-10]。為了進(jìn)一步探討SRC-2對子宮內(nèi)膜異位癥患者孕酮抵抗的作用，本課題隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間在山東省交通醫(yī)院行腹腔鏡或開腹手術(shù)的EMs患者45例和正常對照組35例，觀察ER、PR和SRC-2在EMs患者異位內(nèi)膜組織和正常對照組在位內(nèi)膜組織的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間在本院行腹腔鏡或開腹手術(shù)的EMs患者45例(異位內(nèi)膜組，EMs組)和35例因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)患者非瘤區(qū)對照子宮內(nèi)膜組織(對照內(nèi)膜組)作為研究對象。年齡35～52歲，平均(43.53±9.55)歲。2組患者術(shù)前6個(gè)月內(nèi)均未行激素或者抗子宮內(nèi)膜異位癥的藥物治療，此外沒有內(nèi)科合并癥，而且月經(jīng)周期正常26～31 d。本實(shí)驗(yàn)獲得患者知情同意，且得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和試劑盒 Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國NEB公司)；5 U/μLTaq DNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司)；兔抗人PR單克隆抗體(美國DAKO公司)，工作濃度1:100；兔抗人SRC-2單克隆抗體(美國DAKO公司)，工作濃度1:100；二抗為羊抗兔免疫球蛋白(上海通派生物科技有限公司)，工作濃度1:100。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集：樣本收集參考信聰伶等[11]方法。

1.3.2 RT-PCR擴(kuò)增PR和SRC-2：引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列為：PR上游：5’-AGCCGGTCCGCGTCC-AAG-3’下游：5’-CCACCCAGAGCCCGAGGG-3’SRC-2上游5’-GCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAG-3’下游5’-GTGGAGGAACTCTG-GGAATGTG-3’。具體實(shí)驗(yàn)操作按照RT-PCR試劑盒的說明進(jìn)行，反應(yīng)體系為50 μL，94 ℃下先預(yù)變性4 min，然后按照94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸10 min。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：取RT-PCR的產(chǎn)物10 μL，置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳，相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用pUC Mix Marker，以目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值來確定。

1.4.2 免疫組化檢測結(jié)果判斷：選擇包含異位腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的高倍鏡視野進(jìn)行觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)60個(gè)腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞，然后按照著色程度和著色的百分比來評分。得分標(biāo)準(zhǔn)：弱表達(dá)為1分，中度表達(dá)為2分，強(qiáng)表達(dá)為3分，無表達(dá)為0分，半定量得分=Σ陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 2組子宮的內(nèi)膜組織PR mRNA和SRC-2 mRNA表達(dá)比較 由圖1可知，子宮內(nèi)膜異位組中PR和SRC-2的mRNA的表達(dá)顯著低于對照內(nèi)膜組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 2組子宮內(nèi)膜組織中PR和SRC-2mRNA比較*P<0.05，與對照組相比，F(xiàn)ig.1 Comparison of PR and SRC-2 mRNA expression of endometrial tissue between two groups*P<0.05，compared with control group

2.2 PR mRNA和SRC-2 mRNA在不同月經(jīng)周期中的比較 如圖2所示，PR mRNA和SRC-2 mRNA在對照組中增殖期和分泌期表達(dá)的水平有顯著性差異(P<0.05)。而PR mRNA和SRC-2 mRNA在EMs組中增殖期和分泌期表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 2組子宮內(nèi)膜組織中PR和SRC-2 m RNA在不同月經(jīng)周期中的比較*P<0.05，與增殖期相比Fig.2 Comparison of mRNA between PR and SRC-2 in different menstrual cycles of two groups*P<0.05， compared with proliferative phase

2.3 PR蛋白和SRC-2蛋白在子宮內(nèi)膜組織中比較 由圖3可知，子宮內(nèi)膜異位組中PR和SRC-2的細(xì)胞核內(nèi)可見明顯的棕黃色染色現(xiàn)象，表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性；在對照組中呈現(xiàn)出較弱染色，表達(dá)呈現(xiàn)弱陽性。結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位組中PR和SRC-2的蛋白表達(dá)顯著低于對照內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 EMs組和對照組PR蛋白和SRC-2蛋白的表達(dá)比較Fig.3 Comparison of PR and SRC-2 protein expression between control group and EMs group

3 討論

近年來更多的研究表明[12]，SRC-2在調(diào)節(jié)PR功能上發(fā)揮著十分重要的作用。SRC-2是轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控)之間的“橋梁”蛋白，以多蛋白復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并最終促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄和相關(guān)蛋白的表達(dá)[13-14]。當(dāng)PR與孕酮結(jié)合后，其構(gòu)型發(fā)生改變形成二聚體，該二聚體再通過有序的募集包括SRC家族在內(nèi)的輔激活子來實(shí)現(xiàn)對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[15]。

SRC是最早發(fā)現(xiàn)的一類核受體輔激活子，包括SRC-1、SRC-2和SRC-3。其中SRC-2是子宮PR的優(yōu)勢輔激活子，在子宮內(nèi)膜和平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)與PR具有時(shí)間和空間的一致性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SRC-2表達(dá)缺失可抑制PR介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜發(fā)生脫模樣變化。此外，PR正常的SRC-2基因敲除小鼠患有嚴(yán)重的生育功能缺陷。本研究也顯示，異位癥內(nèi)膜組的PR和SRC-2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均呈陰性，而對照組內(nèi)膜的PR和SRC-2的mRNA和蛋白表達(dá)均呈陽性，而且2組的mRNA和蛋白表達(dá)量也不同，子官內(nèi)膜異癥患者mRNA和蛋白表達(dá)均低于對照組。以上研究表明子官內(nèi)膜異位癥患者存在PR的表達(dá)異常，而SRC-2是子宮PR的優(yōu)勢輔激活子，SRC-2的表達(dá)下降會(huì)顯著消減子宮PR對孕酮的反應(yīng)性。這可能就是子宮內(nèi)膜異位癥患者孕酮抵抗現(xiàn)象的主要分子機(jī)制。

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(編校：譚玲)

Study on effect of steroid receptor coactivator-2 on progesterone resistance in patients with endometriosis

CHANG Yu-hua1,LIU Xiang-huan1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Traffic Hospital of Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Science, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate effect of SRC-2 on progesterone resistance by detecting the expression of progesterone receptor and steroid receptor coactivator-2 in ectopic endometrium of patients with endometriosis and normal endometrium in control group.Methods45 cases of endometriosis patients admitted in department of obstetrics and gynecology of traffic hospital from June 2013 to May 2014 were selected as endometriosis group，and 35 cases ocontrol endometrial tissues in non-tumour region in patients with uterine fibroids who had a hysterectomy as control endometrium group.The expression of PR and SRC-2 in endometriosis and control group were detected by reverse transcription-PCR and immunohistochemistry.ResultsExpression of PR and SRC-2 in endometriosis group were significantly lower than control groups (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 were enhanced in the proliferative phase and gradually weakened along with the secretory phase，existed cyclical variation in menstrual cycle,the difference had statistically significant (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 had no periodic variation in the proliferative and secretory phase,the difference had no statistically significant.ConclusionSRC-2 could regulate transcription reaction of PR genes to promote transcription and protein expression of a target gene,its decreasing expression may lead to the changes of expression in the endometrium PR,PR significantly reduction of uterine progesterone reactivity.

endometriosis; steroid receptor coactivator-2; progesterone receptor; progesterone resistance

山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CL027)；濟(jì)南市科技局科技明星計(jì)劃(20100118)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金(201023)

常玉華，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)，E-mail：qch1821460008@163.com。

R711

A

1005-1678(2015)02-0146-03