二丁酰環磷腺苷鈉的制備及其含量和相關物質的測定

霍婷,孫凱,汪磊,李子健,郭盛強

(西安力邦醫藥科技有限責任公司，陜西 西安 710075)

?

二丁酰環磷腺苷鈉的制備及其含量和相關物質的測定

霍婷,孫凱,汪磊,李子健,郭盛強

(西安力邦醫藥科技有限責任公司，陜西 西安 710075)

目的 制備二丁酰環磷腺苷鈉并測定其含量及有關物質。方法 自制二丁酰環磷腺苷鈉后，采用高效液相色譜法測定其含量和有關物質，色譜條件為：ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(25:75)為流動相，流速1 mL/min，273 nm為檢測波長。結果 二丁酰環磷腺苷鈉為白色粉末狀固體(收率>70%，HPLC>99%)；含量測定線性范圍為20～30 μg/mL，r=0.9997；重復性良好(RSD=0.4%，n=6)；回收率為101.2%(RSD=0.3%)；有關物質定量限為50.08 ng/mL，該濃度下檢測結果穩定；線性范圍為0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；重復性良好(RSD=4.53%，n=6)；回收率為93.5%(RSD=1.8%)。 結論 該合成路線簡單，制備得到二丁酰環磷腺苷鈉純度高，建立的HPLC法測定其含量及有關物質簡便，結果可靠。

二丁酰環磷腺苷鈉；制備；含量；高效液相色譜法；有關物質

環腺苷酸(adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate，cAMP)是生長激素、腎上腺素等多種激素作用的第二信使，是動物機體代謝的重要調節因子。有資料顯示它對心絞痛、急性心肌梗塞、牛皮癬有特效[1]。通過化學方法對cAMP的結構進行改造，在分子中加入兩個丁酰基，使其具有較好的脂溶性，克服了cAMP使用上的局限性，可通過細胞膜在細胞內發揮作用[2]，在細胞內轉變成cAMP，激活蛋白磷酸化酶，增強心肌功能，改善外周血管循環，解除休克時胰島素分泌的抑制，促進組織對糖的攝取，改善能量代謝；還能對抗機體內磷酸二酯酶的降解作用，作用時間較為持久和迅速，因此具有更廣闊的應用前景。為此，本文研究合成了一種新型cAMP的衍生物—二丁酰環磷腺苷鈉(dbcAMP-Na)，該物質合成方法文獻報道較多的是由cAMP經三乙胺鹽保護、吡啶作溶劑酰化后成鹽而成[3-5],本文采用方法將cAMP先制備成鈉鹽，然后以正丁酐既做反應物又做溶劑酰化得到目標產物，該法具有合成步驟少，產品純度高等優點。同時，參考已有報道的鈣鹽有關文獻[6-7]，采用高效液相色譜法對自制dbcAMP-Na的含量及有關物質分析方法進行了系統研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 二丁酰環磷腺苷鈉供試品(力邦醫藥科技有限責任公司自制，5批：140707、140729、140814、140909、140915，制備方法見1.3)，二丁酰環磷腺苷鈉(N6-2′-O-Dibutyryladenosine 3′，5′-cyclic monophosphate sodium salt)對照品(Sigma標準品，Lot#SLBG4203V)，雜質(N6-monobutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt)對照品(Sigma標準品，Lot#129K2101)，環磷腺苷(杭州美亞藥業，國藥準字H20083070)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LumTech高效液相色譜儀(配有Autosampler 5500進樣器，K-2501UV Detecter，WATERS 2998 PDA，Clarity工作站)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌；DZF-6050真空干燥箱。

1.3 二丁酰環磷腺苷鈉的制備 在裝有環磷腺苷的燒瓶里緩慢滴加氫氧化鈉水溶液(3 mol/L)，過程控溫，滴加完畢升溫至室溫，用HCl溶液(20%)調節pH至7～8，加入無水乙醇析出白色固體，過濾、干燥得白色固體鈉鹽；將鈉鹽與正丁酐在N2保護下升溫至140 ℃反應，TLC監控，反應完全后降至室溫，緩慢加入甲基叔丁基醚，過程劇烈攪拌，得近白色固體粗品。甲基叔丁基醚與丙酮的混合溶液重懸得到白色粉末狀目標產物。

1.4 二丁酰環磷腺苷鈉的測定

1.4.1 對照品及供試品溶液：取dbcAMP-Na對照品及自制樣品(批號：140915)各約25 mg，精密稱定，分別置于100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻作為儲備液。精密量取各儲備液5 mL置于50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，即配制成25 μg/mL的對照品及供試品溶液。

1.4.2 高濃度供試品溶液：用十萬分之一的天平取自制dbcAMP-Na樣品約25 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，作為供試品儲備液。再精密量取高濃度儲備液2 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻即為濃度0.5 mg/mL的高濃度供試品溶液。

1.4.3 雜質對照品溶液：精密稱定雜質對照品約25 mg，置于100 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，搖勻做為雜質對照品儲備液。精密量取雜質對照品儲備液1 mL至100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，即配制成2.5 μg/mL的雜質對照品溶液。

1.4.4 色譜條件：色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀與0.01 mol/L TBAB混合溶液(25:75)；流速1 mL/min；檢測波長：273 nm；進樣量：20 μL。

① 線性關系：精密稱取dbcAMP-Na對照品25.65 mg置于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取8、8.8、9.6、10.0、10.4、11.2和12.0 mL分別置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋定容。分別取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積(n=3)。

② 儀器精密度：按照1.4.1項下方法配制得24.93 μg/mL的對照品溶液，按上述色譜條件進行分析，連續進樣6次，分別以峰面積和保留時間考察儀器的進樣精密度。

③ 溶液穩定性：按照1.4.1項下配制得24.47 μg/mL的對照品溶液和25.01 μg/mL的樣品溶液，各取20 μL，分別于0、1、2、4、6、8、12和24 h時注入液相色譜儀，考察2者的溶液穩定性。

④ 重復性：精密稱取dbcAMP-Na同一批次樣品6份，每份約25 mg，按1.4.1項下方法配制成溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，按外標法計峰面積(n=3)。

⑤ 回收率試驗：配制濃度為0.983 mg/mL的對照品儲備液待用，精密量取約15 mg的dbcAMP-Na樣品9份，添加不同量的對照品儲備液，分別配制成濃度為20，25，30 μg/mL的溶液各3份，進行加樣回收率測定。

⑥ 含量測定：取一定量對照品及不同批次自制dbcAMP-Na樣品，按本試驗方法配制溶液，進樣液相色譜分析，外標法計算出各批樣品含量(n=3)。

1.5 相關物質測定

1.5.1 色譜條件同1.4.4項下。

1.5.2 線性關系：精密稱取雜質對照品25.04 mg置于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別量取不同量的7份溶液置入容量瓶中，流動相稀釋成濃度依次為0.050、0.100、1.00、2.00、2.50、3.00、3.75 μg/mL的雜質對照品溶液，取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積(n=3)。

1.5.2 重復性：精密稱取dbcAMP-Na同一批次樣品6份，每份約25 mg，按照1.4.3的方法配制成濃度為50 mg/mL的樣品溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，按外標法計峰面積(n=3)。

1.5.3 回收率試驗：配制濃度為25 μg/mL的雜質對照品儲備液待用，精密量取約25 mg的dbcAMP-Na樣品(雜質含量按0.0211%計)9份，添加不同量的雜質對照品儲備液，分別配制成雜質濃度為1.23，2.48，3.73 μg/mL的溶液各3份，進行加樣回收率測定。

1.5.4 未知雜質測定：按照1.4.2項下的方法配制濃度為0.5 mg/mL的樣品供試溶液，稀釋200倍得濃度為2.5 μg/mL的自身對照溶液。取上述兩種溶液各20 μL分別進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍，各未知雜質峰面積總和小于對照溶液主成分峰的峰面積(0.5%)。采用自身對照法計算雜質含量。

2 結果

2.1 制備的二丁酰環磷腺苷鈉 制備的二丁酰環磷腺苷鈉為白色粉末狀固體(收率>70%，HPLC>99%)已知降解雜質為酯水解產物，結構及HPLC圖譜見圖1、圖2。

圖1 二丁酰環磷腺苷鈉及有關物質結構圖Fig.1 Structure of dbcAMP-Na and its related substances

圖2 二丁酰環磷腺苷鈉HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dbcAMP-Na

2.2 二丁酰環磷腺苷鈉的測定結果

2.2.1 線性關系：3次測定的峰面積平均值對對照品溶液濃度進行線性回歸，回歸方程為：A=38.91C+2.840 r=0.9997，表明在20～30 μg/mL的范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.2.2 儀器精密度：精密度RSD峰面積為1.1%，RSD保留時間為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 溶液穩定性：對照品溶液的平均峰面積為955.121，RSD為1.5%；樣品溶液的平均峰面積為961.630，RSD為1.7%。雜質含量與初始溶液濃度相比無明顯變化，即對照品溶液和樣品溶液至少在24 h內性質穩定。

2.2.4 重復性：樣品平均含量為101.08%，RSD為0.4%(n=6)，表明該法重復性良好。

2.2.5 回收率試驗：加樣回收率高、中、低3個濃度加樣回收率(n=3)依次為101.3%、101.1%、101.3%；總平均回收率為：101.2%，RSD為0.3%，表明dbcAMP-Na在以上3個濃度梯度范圍內回收率良好。

2.2.6 含量測定：各批樣品含量測定結果見表1。

表1 不同批次樣品的含量測定結果Tab.1 Determination result of different batches sample

2.3 有關物質測定結果

2.3.1 最低檢測線和定量限：當信噪比為3時，降解雜質的最低檢測限為12.52 ng；當信噪比為10時，定量限為50.08 ng，該樣品連續進樣6針，計算平均保留時間為6.153 min，RSD值為0.11%，平均峰面積為2.364，RSD值為2.26%，說明在該定量限下，檢測值穩定。

2.3.2 重復性：dbcAMP-Na同一批次樣品的平均含量為0.0211%，RSD為4.53%(n=6)，表明該法重復性良好。

2.3.3 線性關系：3次測定的峰面積平均值對雜質對照品溶液濃度進行線性回歸，回歸方程為：A=43.53C+0.343，r=0.9999，表明在0.05～3.75 μg/mL的范圍內雜質峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3.4 回收率試驗：高、中、低3個濃度雜質加樣回收率(n=3)依次為95.4%，92.2%，93.0%；總平均回收率為：93.5%， RSD為1.8%，表明該降解雜質在以上3個濃度梯度上回收率良好。

2.3.5 未知雜質測定：6份樣品中各未知雜質平均含量均小于0.5%，雜質峰面積RSD均小于10%。

3 討論

檢測波長的選擇取一定量的二丁酰環磷腺苷鈉對照樣品，配制成約50 μg/mL的溶液，用分光光度法在200～400 nm的波長范圍內掃描，結果本品在272.3 nm的波長處有最大吸收，將檢測波長定為273 nm；流動相的選擇 采用乙腈-水(25:75)為流動相，考慮到樣品鈉鹽易電離，極性大，在流動相中加入磷酸二氫鉀緩沖鹽，并加入少量表面活性劑增加其溶解性，能顯著改善拖尾，得到較好的色譜圖形。改變流動相流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min，柱溫分別為30、35、40 ℃條件下以及采用2種不同的色譜柱(Agilent 5 TC-C18(2)；Ultimate XB-C18)進行檢測，平均含量為99.16%，RSD為0.6%(n=3)。經驗證，該檢測方法重現性好，操作簡便、快速、準確，可用于該藥的質量控制。

本法專一性強，含量和有關物質測定的準確度和精密度均好，完全能夠滿足二丁酰環磷腺苷鈉質量分析的要求，為控制二丁酰環磷腺苷鈉的質量提供了可靠的定量方法依據。

[1] 馬世昌.化學物質辭典[M].西安：陜西科技技術出版社，1999：428.

[2] 高市爭，張曦，劉勇，等.二丁酰環腺苷酸的合成與性質研究[J].中國畜牧雜志，2004，40(2)：16-18.

[3] Newton RP, Walton TJ. Evans AM,et al. Identification of cyclic nucleotide derivatives synthesized for radioimmunoassay development by fast atom bombardment with collision-induced dissociation and mass-analysed ion kinetic energy spectroscopy[J].Organic Mass Spectrometry, 28(8):679-688.

[4] Yamasa Shoya KK,JGC Corp,Kansai Paint Co.LTD.Process for producing ribonucleosides[P].DE 2416709,1974.

[5] Chait EM,Choi SY,Greensboro,et al.Synthesis and method of purification of cycfic nucfeo tide derivatives.[P].US186282 A1,2004.

[6] 饒印保，鄭金芳.注射用二丁酰環磷腺苷鈣含量高效液相測定法[J].江西中醫學院學報，2006，18(6)：36.

[7] 馮新俠，閆平川.高效液相色譜法測定二丁酰環磷腺苷鈣及其凍干粉針的含量[J].海南醫學院學報，2008，14(1)：19-21.

(編校：王冬梅)

Preparation of sodium dibutyryladenosine cyclophosphate and the determination of the content and related substances

HUO Ting,SUN Kai,WANG Lei,LI Zi-jian,GUO Sheng-qiang

(Xi’an Libang Pharmaceutical Co.LTD, Xi’an 710075, China)

ObjectiveTo prepare sodium dibutyryladenosine cyclophosphate(dbc AMP-Na)，and determine the content and related substances. MethodsDetermine the content and related substances of dbcAMP-Na by high performance liquid chromatography after prepared,The column：ODS C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；the mobile phase：acetonitrile-0.05mol/mL KaH2PO4solution(25:75)；the flow rate：1 mL/min；the content of dbcAMP-Na was detected at 273 nm. ResultsThe linear range of the determination of the content was 20～30 μg/mL，and the correlation coefficient was 0.9997；The precision was good(RSD=0.4%，n=6)；The recovery result was 101.2%(RSD=0.3%). The quantitative limit of relevant material is 50.08 ng/mL，which is stable under this concentration；The linear range of the determination was 0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；The precision was good(RSD=4.53%，n=6)；The recovery result was 93.5%(RSD=1.8%). ConclusionThe synthetic route of dbcAMP-Na is simple and with high product purity. The method to determine the content and related substances of dbcAMP-Na is easy to operate and the results of the determination are accurate。

sodium dibutyryladenosine cyclophosphate;prepare;content; HPLC;related substances

霍婷，女，碩士，工程師，研究方向：原料藥及藥物的合成制備與分析，E-mail：huoting-714@163.com。

R927

A

1005-1678(2015)02-0171-03