柴胡對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的干預作用

張 奇,林成仁,李 濤

柴胡對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的干預作用

張 奇,林成仁,李 濤

目的探討柴胡對自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠干預作用,為臨床應用柴胡治療多發性硬化(MS)提供依據。方法C57雌性小鼠40只,隨機分為空白對照組、EAE模型組、潑尼松組[7.8 mg/(kg·d)]和柴胡組[1.95 g/(kg·d)],每組10只。EAE模型組、潑尼松組和柴胡組6周齡時用MOG35-55多肽免疫建立EAE模型,造模后第3天灌胃給予蒸餾水或藥物至實驗結束。自造模當天觀察各組小鼠體重、行為學;造模后第16天(發病高峰期)取脊髓組織行HE染色,觀察炎性細胞浸潤情況;采取尾靜脈血,檢測與多發性硬化主要相關炎癥因子白細胞介素(IL)17E、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-4、IL-21、IL-10、IL-23、IL-12(p70)、IL-17A、IL-17F和腫瘤壞死因子(TNF) α水平。結果與空白對照組比較,EAE模型組小鼠發病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高(P<0.05),IL-4水平降低(P<0.05);與EAE模型組比較,發病高峰期潑尼松組外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低(P<0.05或P<0.01),柴胡組IL-17E和IFN-γ水平降低(P<0.05或P<0.01)。結論柴胡通過抗炎機制減輕EAE小鼠的病情,可作為MS治療的參考。

自身免疫性腦脊髓炎;多發性硬化;柴胡;潑尼松;炎性細胞因子

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是人類中樞神經系統的自身免疫性疾病,以髓鞘脫失和進行性神經功能喪失為主要特點[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis, EAE)的臨床表現、免疫學和病理組織學方面都與MS相似,因而EAE被普遍應用于研究MS臨床和病理學特征動物模型[2]。細胞因子參與炎癥反應的調節,與MS急性期病情密切相關[3]。由Th1和Th17分泌的γ-干擾素(IFN-γ)和白細胞介素(IL) -17已經被檢測存在于MS病灶中[4]。尤其IL-17促進炎癥發生,可以激活T細胞和其他免疫細胞,產生多種細胞因子、趨化因子和細胞黏附分子。IL-17在EAE的發生發展中起重要作用[5]。而Th2或Treg細胞相關的細胞因子例如IL-4和IL-10可以減輕炎癥反應,改善MS患者的癥狀[6]。柴胡為導師李濤教授治療MS的常用藥物[7],本研究采用C57小鼠EAE作為動物模型,探討柴胡對EAE小鼠模型的干預作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性C57BL/6小鼠4周齡,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,合格證號SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物 柴胡顆粒(中國中醫科學院西苑醫院顆粒藥房提供),潑尼松片(天津力生制藥股份有限公司生產,批號1303040)。

1.3 試劑MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,上海吉爾生化公司合成,純度98.4%,批號:P130819-XZ051716),百日咳毒素(PT,Catalog Number:P7208,Sigma),滅活結核桿菌H 37RA(100 mg,Lot Number:2072054,Difco),完全弗氏佐劑(F5881-10ml,Lot Number:SLBB1387,Sigma),蛋白液相芯片試劑盒(美國EMD Millipore公司Cat.# MTH17MAG-47K),Mouse Th17 Magnetic bead panel(美國EMD Millipore公司Cat.#MTH17MAG-47K)。

1.4 儀器 Luminex液相芯片檢測技術平臺(美國EMD Millipore公司),ICE-CL31R低溫離心機(美國Thermo公司)。

1.5 動物飼養環境 飼養于中國中醫科學院西苑醫院實驗動物中心動物房。動物飼養條件:溫度20℃～ 25℃,標準12h光照/12h黑暗節律,標準飼料和飲水。

1.6 方法

1.6.1 分組與造模 隨機分為4組:空白對照組、EAE模型組、潑尼松組和柴胡組,每組10只,適應2周后造模。將髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)粉按2 mg∶1 mL比例溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中,完全弗氏佐劑加結核桿菌5 g/L,將MOG35-55水溶液與同體積的佐劑混合,充分乳化;50μg PT,用25 mL 0.01 mol/L PBS液溶解,濃度為2μg/mL。每只小鼠注射0.2 mL的乳化劑,MOG35-55注射量為每只200μg。經小鼠背部皮下分3～4點注射0.2 mL抗原配劑。于造模當天、第2天每只小鼠腹腔注射200 ng百日咳毒素。

1.6.2 動物行為學觀察 自造模當天起,每天對小鼠進行稱重并進行EAE評分。EAE評分標準[8]:0分,無臨床癥狀;0.5分,部分尾癱;1分,完全尾癱;2分,失去協調運動和后肢部分癱瘓;2.5分,一側后肢全癱;3分,雙側后肢全癱;3.5分,雙側后肢全癱伴有前肢力量減弱;4分,雙側前肢癱瘓;5分,死亡。

1.6.3 給藥方式及途徑 造模后第3天開始灌胃給藥,每日1次。潑尼松組予潑尼松7.8 mg/(kg·d)灌胃,柴胡組予柴胡顆粒1.95 g/(kg·d)灌胃,空白對照組和EAE模型組給予等量純水灌胃。

1.6.4 外周血中主要相關細胞因子的檢測 于造模后第16天(發病高峰期)尾靜脈采血(n=3)。全血常溫靜止1 h后,高速離心,取上層血清,-80℃保存。采用Merck Millipore公司的液相芯片Luminex技術,由Milliplex analyst軟件進行數據分析。

1.6.5 HE染色 實驗動物于造模后第16天(發病高峰期)水合氯醛麻醉后,先以適量生理鹽水經左心室沖洗,待沖洗液清亮后,繼以4%多聚甲醛灌注固定,然后切取脊髓腰膨大部位浸泡于30%蔗糖后固定液中。石蠟包埋后按5μm厚度連續切片,切片行HE染色。

1.7 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示。多組數據比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett T3法。重復測量數據采用重復測量方差分析法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠發病情況及行為學觀察 造模后正常對照組小鼠精神活動正常,體重逐漸增加。EAE模型組(灌胃死亡1只,給予剔除)、潑尼松組、柴胡組發病動物表現精神差、攝食減少、毛色淡暗無光、體重下降、共濟失調等。3組造模后以潑尼松組發病最晚,柴胡組略晚于EAE模型組,但差異無統計學意義;以潑尼松組的最高平均評分最低,高峰期持續時間最短,其次為柴胡組,且各組間差異有統計學意義。表明柴胡可以減輕EAE小鼠發病,縮短高峰期發病時間,但作用不及潑尼松。詳見表1。

表1 各組小鼠發病情況及行為學評分比較

2.2 發病高峰期中樞神經系統炎癥浸潤情況 與空白對照組脊髓組織HE染色比較,高峰期EAE小鼠腰髓組織內呈大量的單核淋巴樣細胞浸潤,可見明顯“袖套樣”改變。與同時間點的EAE模型組比較,潑尼松組和柴胡組小鼠脊髓組織內的淋巴細胞浸潤明顯減輕,尤其是潑尼松組接近空白對照組小鼠組織。

2.3 發病高峰期外周血中炎性細胞因子水平的變化

與空白對照組比較,EAE模型組小鼠發病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高,IL-4水平降低,差異有統計學意義;IL-17A、腫瘤壞死因子(TNF-α)有上升的趨勢,但差異無統計學意義。IL-10、IL-12p70和IL-23各組間差異無統計學意義。IL-21未能檢測出。與EAE模型組比較,發病高峰期潑尼松組外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低,柴胡組IL-17E和IFN-γ水平降低,但降低程度不及潑尼松組,差異有統計學意義。詳見表2。

表2 發病高峰期各組外周血中炎性細胞因子水平的變化(±s) pg/mL

表2 發病高峰期各組外周血中炎性細胞因子水平的變化(±s) pg/mL

_____________________________________________組別nIL-17E_______________________________ _IFN-γIL-17F_____________________________________________ IL-4IL-17A空白對照組3193.56±9.911.42±0.273.50±0.710.38±0.030.02±0.00 EAE模型組3296.85±44.121)2.14±0.241)45.32±4.971)0.12±0.031)0.22±0.13潑尼松組3 77.20±13.163)0.48±0.103)5.85±0.772)0.20±0.070.01±0.01 _柴胡組_____________________3___________ _201.41±26.612)4)___0.87±0.173)5)________75.53±13.69_______1.4_______________________________ 9±1.260.05±0.03 _____組別TNFαIL10IL12p70IL23空白對照組1.05±0.151.19±0.086.64±1.2520.02±0.90 EAE模型組3.28±0.851.29±0.122.83±0.136.97±2.64潑尼松組0.80±0.041.08±0.161.64±0.412.14±0.37 _柴胡組5.57±1.181.30±0.041.86±0.2518.27±6.47 _____與空白對照組比較,1)P<0.05;與EAE模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01;與潑尼松組比較,4)P<0.05,5)P<_________________ 0.01。

3 討 論

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白特定地表達于中樞神經系統髓鞘最外層薄板和細胞上及少突膠質細胞中,是MS脫髓鞘過程的關鍵性自身抗原,MOG35-55誘導C57小鼠的EAE與MS有著相似臨床表現和病理學特征,廣泛應用于MS動物實驗研究。本實驗EAE模型組小鼠行為學表現為:發病時出現體重下降,尾癱和肢體癱瘓。造模后EAE小鼠發病率在50%左右,個體小鼠最高評分3分,接近文獻報道[9]。IL-17家族是近來發現的細胞因子家族,有6名成員分別是: IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E和IL-17F。主要由效應CD4+Th17細胞(Thelper17, Th17)分泌。IL-17 A(即狹義上的IL-17)是最早克隆的IL-17家族成員,與IL-17F一樣,主要由CD4+Th17細胞產生。IL-17具有免疫調節、粒細胞募集、介導信號轉導等多種作用,在MS患者外周血單核細胞和腦脊液中表達升高[10]。EAE發病前期和高峰期中樞神經系統組織的IL-17mRNA和IL-17水平升高,緩解期下降,IL-17mRNA表達水平與EAE病情呈正相關[11]。IFN-γ是一種重要的細胞因子,主要由Th1細胞產生,促進炎癥的發生。Simpson等[12]觀察到IFN-γ對MS復發有很強的影響力,增加IFN-γ可以明顯增加MS的復發率。通過對脾細胞分泌的細胞因子mRAN表達水平檢測發現:在第1次發病時,脾細胞分泌IFN-γ增加,其mRNA表達水平升高[13]。顯示IL-17和IFN-γ在MS和EAE發病中起著重要的作用。IL-4是天然CD4+T細胞向Th2細胞分化的關鍵,可以減輕炎性脫髓鞘疾病病情[14]。本實驗通過對各組小鼠外周血中細胞因子水平檢測,發現發病高峰期EAE小鼠外周血中IL-17E、IL-17F和IFN-γ水平升高,IL-4水平降低;潑尼松降低小鼠發病高峰期外周血中的IL-17和IFN-γ水平抑制炎癥反應,柴胡可降低外周血中IL-17E和IFN-γ水平減輕炎癥反應,但強度不如潑尼松。

造模3組中以EAE模型組發病最早,病情最重,柴胡組與EAE模型組相比發病稍晚,病情較輕,但柴胡組作用次于潑尼松組。臨床上糖皮質激素通常用于MS急性發作期治療,但長期使用糖皮質激素治療MS療效目前并不確定,且可導致嚴重副反應[15]。柴胡及其復方制劑可以作為治療的選擇之一。

柴胡味苦,性微寒,歸肝膽經,具有和解表里、疏肝、升陽的作用,是疏肝解郁代表藥物。李濤教授認為多發性硬化與肝關系密切,MS癥狀表現多樣,肢體抽搐和共濟失調都與風邪亢盛有關?！秲冉洝げC十九條》:“諸風掉弦皆屬于肝”;肝為將軍之官,主疏泄,調暢一身之氣。MS患者因久受病痛之苦,多伴有肝氣郁結,故從肝論治,采用疏肝健脾益髓方治療MS,柴胡是其中重要藥物[4]。現代藥理學研究柴胡具有解熱、鎮靜、鎮痛、抗炎等作用[16]。柴胡主要化學成分為皂苷類、黃酮類、揮發油類、多糖類及其他類化學成分,研究表明柴胡皂苷類有顯著的抗炎效果,對多種炎癥過程包括炎性滲出、毛細血管通透性升高、炎性介質釋放、白細胞游走等均有抑制作用[17]。本實驗從動物行為學和組織病理學證明柴胡對于EAE模型小鼠病情有一定緩解作用,抗炎作用是干預的主要途徑。

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Intervention Effect of Chaihu on Inflammation in Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Zhang Qi,Lin Chengren,Li Tao
Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China Corresponding Author:Li Tao

ObjectiveTo explored the effect of Chaihu for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE),and to provide laboratory evidence for clinical application of Chaihu treating multiple sclerosis.MethodsC57 mice were immunized by MOG 35-55 to establish EAE,the model of multiple sclerosis.Forty mice were divided into blank control group,EAE model group,predn-i sone treatment group and Chaihu treatment group,which

oral administrations of different drugs after immunized 3 days.The mice behavior,checked daily and graded on clinical score were observed.It had been observed that cytokines levels of peripheral blood,relating to multiple sclerosis major factors,and inflammatory cell infiltration in spinal by HE staining after immunized 16 days.ResultsCompared with control group,the level of interleukin(IL)17E,IL-17F,interferon(IFN )-γwere increased while the level of IL-4 was decreased in EAE group(P<0.05).Compared with the EAE group,the level of IFN-γand IL-17E significantly reduced in Chaihu group.The difference has statistic significance(P<0.05 orP<0.01).ConclusionChaihu has theapeutic effect on the EAE mice by anti-inflammation.

experimental autoimmune encephalomyelitis;multiple sclerosis;Chaihu;prednisone;cytokines

R744 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.019

1672-1349(2015)06-0760-04

2014-12-06)

(本文編輯郭懷印)

中國中醫科學院西苑醫院(北京100091)

李濤,E-mail:lt0016@263.net