左乙拉西坦對偏頭痛大鼠血漿中降鈣素基因相關肽及一氧化氮含量的影響

劉曉東,童宇平,牛爭平

左乙拉西坦對偏頭痛大鼠血漿中降鈣素基因相關肽及一氧化氮含量的影響

劉曉東1,童宇平2,牛爭平2

目的觀察左乙拉西坦(LEV)對硝酸甘油致大鼠偏頭痛模型血漿中降鈣素基因相關肽(CGRP)及一氧化氮(NO)含量的影響。方法24只清潔健康的雄性Wistar大鼠,采用皮下注射硝酸甘油/生理鹽水制備偏頭痛大鼠模型,造模后LEV高、低劑量組分別給予LEV 200 mg/kg、100 mg/kg灌胃,在30 min、60 min、180 min三個時間點采集大鼠血漿標本,分別運用酶聯免疫吸附劑測定法測定CGRP,硝酸還原酶法測定NO的含量。結果LEV高劑量組、LEV低劑量組各時間點血漿中CGRP及NO含量與空白對照組和模型對照組相比均有統計學意義(P<0.05)。結論LEV高劑量組、低劑量組均可降低偏頭痛大鼠血漿中CGRP及NO的含量,且LEV高劑量組在降低CGRP和NO含量變化的趨勢較LEV低劑量組明顯,提示左乙拉西坦可能是通過下調CGRP和NO含量而改善實驗大鼠的偏頭痛癥狀。

偏頭痛;左乙拉西坦;降鈣素相關基因肽;一氧化氮

偏頭痛是原發性頭痛中最常見的一種慢性神經血管性頭痛[1]。近年來各國報道的患病率升高,可能和人們的生活習慣、壓力及環境因素等有關。世界衛生組織(WHO)將嚴重的偏頭痛發作列為類同于癡呆、四肢癱瘓和嚴重精神疾病[2],是目前危害人類健康的慢性疾病之一。這是因為除了偏頭痛本身發作時給患者造成損害外,其反復的發作還可以進一步導致患者在其他方面的損害諸如短暫性腦缺血發作、認知功能下降等。但偏頭痛發病機制至今尚未研究清楚。近年來發現降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)、一氧化氮(nitric oxide,NO)在偏頭痛發病機制過程中起著十分關鍵的作用[3]。本研究旨在觀察左乙拉西坦(LEV)對硝酸甘油(NTG)致大鼠偏頭痛模型血漿中CGRP及NO含量的影響,以探討LEV治療偏頭痛的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級Wistar大鼠24只,體重在250 g～300 g,由山西醫科大學實驗動物中心提供,安靜屏蔽環境下喂養,室溫在22℃,壓強梯度為30 Pa,相對濕度為50%,鼠籠為白色塑料籠具,墊料為消毒木質,飲用水為消毒去離子水,飼養用普通顆粒鼠糧。

1.2 藥品和試劑 硝酸甘油(NTG)針劑(每支5 mg,北京益民藥業有限公司生產)。LEV片(每片0.5 g, UCB Pharma S.A.生產),用蒸餾水配成LEV溶液高[200 mg/(kg·mL)]、低[100 mg/(kg·mL)]劑量備用。蒸餾水及10%水合氯醛注射液均由山西醫科大學動物實驗中心提供。CGRP試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司,NO試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模、分組方法 將24只清潔健康的雄性Wistar大鼠,根據Tassorelli[4]造模方法隨機分為空白對照組(6只)及模型組(18只)。模型組采用皮下注射硝酸甘油10 mg/kg制備偏頭痛大鼠模型,空白對照組大鼠皮下注射等劑量生理鹽水。行為學觀察指標為頻繁撓頭、爬籠、耳紅和倦怠4項;空白對照組皮下生理鹽水注射,大鼠出現較短時間的次數較少的撓頭、爬籠動作,但始終未見耳紅現象。造模成功后,隨機將大鼠分為模型對照組、LEV高劑量組、LEV低劑量組,每組6只。24 h后各組大鼠再次給予NTG皮下注射誘導其偏頭痛發作,空白對照組仍皮下注射生理鹽水;第 2次誘發大鼠偏頭痛發作后10 min,空白對照組和模型對照組大鼠給予蒸餾水灌胃,根據黃繼漢等[5]關于動物與人體間的等效劑量換算計算大鼠灌藥劑量, LEV高劑量組按200 mg/kg配置成1 mL溶液灌胃, LEV低劑量組按100 mg/kg配置成1 mL溶液灌胃。

1.3.2 標本采集 分別在空白對照組、模型對照組、LEV高劑量組、LEV低劑量組灌胃后的30 min、60 min、180 min三個時間點,經大鼠連續斷尾取血法[6,7]用EDTA抗凝管收集標本,離心20 min(2 000 r/min),收集上清液待檢。

1.3.3 CGRP含量的測定 將標準品配制成20 ng/mL的溶液。洗滌液用重蒸餾水1∶20稀釋。酶標板上打孔,檢測程序為經過加樣、洗板、加入蒸餾水和第一抗體工作液、洗板、加入酶標抗體工作液100μL、洗板、每孔加入底物工作液100μL、每孔加入終止液、酶標儀450 nm處測吸光值。以標準品為橫坐標,OD值為縱坐標,使用軟件作圖并根據樣品OD值計算出相應CGRP含量,再乘以稀釋倍數。

1.3.4 NO含量的測定 取3個試管,依次標記為空白管、標準管、測定管,分別放入蒸餾水、標準應用液、樣本各0.1 mL,再依次加入試劑一和試劑二各0.2 mL混均,37℃準確水浴60 min;再加入試劑三0.2 mL和試劑四0.1 mL,充分漩渦混均30 s,室溫靜置10 min,3 500 r/min～4 000 r/min,離心10 min,取上清顯色;取上清液及顯示液各0.5 mL混均,室溫靜置10 min,蒸餾水調零,550 nm,0.5光徑,測各管吸光度值,根據血漿中測定結果計算NO的含量。

1.4 統計學處理 CGRP、NO含量和行為學指標均為重復定量資料,采用兩因素重復測量資料方差分析。采用SPSS19.0軟件進行統計學處理。檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 行為學觀察 通過對大鼠各時間段行為學指標觀察(撓頭、咬趾、爬籠、往返運動等),發現空白對照組大鼠皮下注射生理鹽水后30 min內大鼠相關行為學改變明顯多于本組其他時間段,可能為灌胃引起的應激反應所致。LEV高、低劑量組與模型對照組、空白對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05);LEV高、低劑量組各時間點比較,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時間段行為學評分比較(±s) 分

表1 各組大鼠不同時間段行為學評分比較(±s) 分

___組別____n______30 min_____30 min～90 min 90 min～180 min空白對照組612.08±1.54 3.92±1.32 4.50±1.38模型組 619.17±2.421)22.33±1.661)14.40±1.201)高劑量組 614.33±1.051)2)18.17±1.911)2)3)6.92±1.431)2)3)低劑量組__ __6_16.08±1.691)2)19.33±1.631)2)3)8.25±2.231)2______)3)與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P< _0.05;與同組30 min比較,3)P<0.05___________________________。

2.2 CGRP及NO含量變化 經過兩因素重復測量方差分析,4組間CGRP、NO水平差異有統計學意義(P<0.05),LEV高、低劑量組與模型組、空白對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05);LEV高、低劑量組各時間點比較,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組大鼠不同時間點血漿中CGRP含量變化(±s) pg/mL

表2 各組大鼠不同時間點血漿中CGRP含量變化(±s) pg/mL

________組別n 30 min__________________________60 min180 min空白對照組645.063 7±1.278 842.888 3±1.631 641.497 8±1.258 7高劑量組 6 63.076 5±8.197 21)2)3)53.746 5±1.590 61)2)3)4)50.009 8±1.428 01)2)3)4)低劑量組 6 59.779 3±2.940 41)2)54.990 8±3.167 91)2)4)52.788 7±3.194 71)2)4)_____模型組________________ __________6______________59.066 8±2.919 91)64.428 5±7.502 21)58.625 3±2.638 81)_____與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05;與低劑量組比較,3)P<0.05;與同組30 min比較,4)P<________________ 0.05。

表3 各組大鼠不同時間點血漿中NO含量變化(±s) μmol/L

表3 各組大鼠不同時間點血漿中NO含量變化(±s) μmol/L

________組別n 30 min_________________________60 min180 min空白對照組635.926 7±1.184 9 34.864 5±0.991 0 34.439 7±0.921 0高劑量組 6 81.033 0±10.304 31)2)3)77.199 2±7.940 31)2)3)4)74.780 3±8.498 91)2)3)4)低劑量組 684.685 3±5.018 11)2)81.652 5±3.319 11)2)4)80.856 8±3.737 21)2)4)_____模型組_______________ _________6_____________87.881 5±10.497 11)90.458 0±10.349 11)89.321 8±9.844 41)_____與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05;與低劑量組比較,3)P<0.05;與同組30 min比較,4)P<_______________ 0.05。

3 討 論

偏頭痛的發病機制迄今尚未完全明確,就目前研究現狀,主要支持三叉神經血管學說。大量實驗證明神經遞質和血管活性物質在偏頭痛發作中有著重要的作用[8],而CGRP及NO在偏頭痛發作中可能起著十分關鍵作用。NO既是神經遞質,又是血管內皮舒張因子(EDRF),不僅能激發偏頭痛發作,而且對維持偏頭痛狀態也很重要。NO致偏頭痛可能與其擴血管作用有關聯[9]。偏頭痛發作中,起重要作用的血管活性物質需要NO來擴張腦血管[10]。NO在偏頭痛發病過程中可能是通過擴張腦血管以及介導血管周圍神經源性炎癥和易化傷害沖動的中樞傳遞,參與偏頭痛病理生理過程。連亞軍等[11]對偏頭痛患者血漿中NO含量測定,觀察到偏頭痛患者發作時NO含量較正常人顯著升高。

CGRP是目前已知舒血管作用最強的物質,并且在感覺疼痛和調控中也發揮著重要作用,廣泛分布在中樞神經系統中。臨床研究證實偏頭痛發作時,血漿中CGRP水平升高,且偏頭痛發作的持續時間和強度與血漿中CGRP水平呈正相關[12]。Goadsby等[13]觀察偏頭痛發作時,患者頸外靜脈CGRP含量升高,但肘靜脈血中升高不明顯,提示偏頭痛發作時顱內釋放CGRP為主。連亞軍等[11]觀察到偏頭痛患者發作時頸靜脈血中NO及CGRP的含量較正常人顯著升高,肘靜脈中CGRP沒有增加。

本實驗根據Crisina等[14]報道的NTG誘發的實驗性偏頭痛動物模型,通過斷尾取血法采取血液標本,分別運用酶聯免疫吸附劑測定法測定CGRP和硝酸還原酶法測定NO的含量,結果顯示模型對照組大鼠CGRP和NO明顯高于其他組,NTG致大鼠偏頭痛模型能使CGRP和NO的含量增加,提示CGRP和NO在偏頭痛發作中發揮重要作用。為避免對實驗結果以及外界環境對實驗動物的影響,選擇在安靜屏蔽條件下飼養實驗大鼠以及進行整個實驗過程,為減少對大鼠的各種刺激,選擇獨立環境進行單鼠實驗操作。

近年來臨床觀察發現LEV在防治頭痛方面具有可靠療效。2001年Krusz[15]首先提出了LEV對頑固性偏頭痛和其他頭痛綜合征具有預防作用,對先兆性偏頭痛患者,LEV也顯示出較好的療效和安全性。Ann等[16]觀察發現LEV可減少兒童偏頭痛發作次數和降低致殘程度方面有很好的療效,除了有輕微的行為改變外,無其他副反應。王維等[17]應用LEV單藥和LEV聯合鹽酸氟桂利嗪治療偏頭痛患者120例,觀察到聯合用藥組頭痛持續時間、發作次數、頭痛程度等臨床癥狀改善情況明顯優于單藥組,且治療總有效率明顯優于單藥,兩組治療期間均未發生明顯不良反應。一項關于慢性頭痛的多中心研究證明,LEV組與安慰劑組相比,頭痛發作率明顯降低[18]。Verma等[19]進行了關于LEV對偏頭痛預防的隨機對照研究,結果顯示LEV明顯降低了頭痛發作的次數和頭痛程度。

由上述文獻報道可見在治療偏頭痛方面LEV有一定的療效,副反應少。但根據所檢文獻顯示,大多是關于臨床療效的研究,而就輔助檢查指標以及闡述LEV對頭痛作用機制的動物實驗少有報道,因此關于LEV治療頭痛的具體藥理機制仍不清楚,這就影響了關于LEV治療頭痛的標準化及規范化治療。因此,探討LEV對頭痛防治的作用機制尤顯重要。

本實驗通過觀察高、低劑量LEV對NTG致偏頭痛大鼠模型的頭痛治療作用以及用藥過程不同時間點對實驗大鼠血漿中CGRP和NO的含量變化的影響,發現造模后LEV高、低劑量組偏頭痛大鼠血漿中CGRP和NO的含量與模型對照組相比明顯降低。重復測量方差分析結果顯示,給藥劑量和時間對緩解偏頭痛大鼠的撓頭、爬籠、咬尾/趾、煩躁等行為學癥狀以及降低血漿中CGRP和NO的影響較為明顯,提示LEV可能是通過減少CGRP和NO的產生而緩解偏頭痛癥狀的。目前還不能認為高劑量的LEV能夠產生更加大的治療效果,仍需進一步增加樣本量、多次誘發實驗大鼠頭痛發作和多次給藥,以增加實驗數據的準確性和減少實驗誤差。

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R747.2 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.020

1672-1349(2015)06-0763-04

2015-02-02)

(本文編輯郭懷印)

國家臨床重點專科建設項目(No.2013-544)

1.山西醫科大學(太原030001);2.山西醫科大學第一醫院

牛爭平,E-mail:nzp105@sina.com