紫外可見分光光度法測定民族民間藥山茶花中咖啡因的含量

孫 超 屈愛桃 李 洋 劉翔宇 牧 丹 于 西

(內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059)

山茶花(CameLLia japonica L.)為山茶科山茶屬植物，始載于《本草綱目》，又名茶花，小茶花，山茶，耐冬等。具有抗癌、抗菌、抗骨質疏松及抑制心腦血管疾病等功效［1］。同時，山茶花味辛苦、涼，無毒，還具有涼血、止血、散瘀、消腫之功能，用于治療吐血、血崩，腸風、血痢、血淋、跌撲損傷、燙傷等［2］。在尋找其藥理作用的同時，對其進行化學成分研究時發現其含有大量咖啡因。因此，本實驗利用紫外分光光度法對山茶花樣品中咖啡因含量進行提取和含量測定。

1 儀器、藥品和試劑

1.1 試驗儀器: 圓底燒瓶(若干)、容量瓶200mL(若干)、容量瓶50mL(若干)、移液(若干)、量筒、鐵架臺等。ZKB-1 -4 型循環水多用真空泵(山東省鄄城華魯電熱儀器有限公司);紫外可見分光光度計(TU -1901，北京普析通用儀器有限責任公司);水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試驗藥品與試劑: 山茶花(不同批次，天立藥業有限公司，經內蒙古醫科大學藥用植物教研室喬俊纏教授鑒定為山茶科山茶屬山茶花);對照品: 咖啡因(上海試劑二廠)乙酸鉛: 天津市化學試劑六廠(批號20091208);濃硫酸: 呼和浩特市化學試劑廠(批號XK13 -001 -0304009II);鹽酸: 北京化工廠(批號20111209)。

2 方法與結果

2.1 咖啡因標準品溶液的制備: 精密稱取咖啡因對照品5.00mg，置于100mL 容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得到濃度為50μg·mL-1的咖啡因對照品溶液，備用。

2.2 測定波長的選擇: 將紫外可見分光光度計的掃描波長定為200 ～400nm，取2 份蒸餾水樣進行基線掃描，待基線平穩后，分別取供試品溶液和對照品溶液在紫外分光光度計上于200 ～400nm 波長處進行掃描，結果對照品與供試品溶液在273nm 處均有最大吸收，故確定273nm 為檢測波長(圖1，圖2)。

3.3 標準曲線的繪制: 精密移取咖啡因對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 的對照品溶液至25mL 容量瓶中，分別加蒸餾水定容至刻度，得到濃度分別為4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg·mL-1的咖啡因對照溶液見表1。對咖啡因的對照品溶液進行測定，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標得到咖啡因的濃度-吸光度標準曲線，回歸方程為A =0.0502x-0.0011 ，r=0.9998，線性范圍為4 ～20μg·mL-1，結果見圖3。

表1 不同濃度咖啡因對照品溶液的吸光度

3.4 供試品提取條件的考察及結果分析: 為了確保提取質量，以控制樣品咖啡因的含量為指標，選出提取時間，提取溫度，料液比例3 個提取因素，每個因素3 個水平(表2)的L9(34)正交設計方案，經9 次試驗得出最佳提取條件。

正交實驗結果分析: 對正交試驗有關數據作極差分析，結果見表2、3，影響因素中，提取溫度影響最大、其次是料液比、提取時間影響最小，提取工藝各因素對咖啡因提取率影響程度依次為C3 ＞A3 ＞B2，因此，料液比為1: 150，提取時間為1.5h，提取溫度為95℃時為山茶花中咖啡因提取的最優條件，為山茶花的供試品溶液制備提供了依據。正交設計及結果見表3。

表2 水平與因素

表3 正交試驗L9(34)

3.5 供試品溶液的制備: 稱取山茶花粉末約1.0g，精密稱定。加150mL 蒸餾水于圓底燒瓶中在95℃水浴鍋中加熱1.5h，立即趁熱抽濾，轉移至200mL 容量瓶中并加蒸餾水至刻度，從容量瓶中精密吸取12.0mL 溶液，加入50mL 的容量瓶中，再向其中精密加入0.01mol HCl5.0mL 及50%的醋酸鉛1.0mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置抽濾。在濾液中滴入3 滴濃硫酸，再次靜置抽濾。精密吸取濾液25.0mL 轉移至50mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，得供試品溶液。

3.6 方法學考察

3.6.1 穩定性試驗: 精密吸取同一份供試品溶液，每隔2h測定其吸光度，觀察吸光度的變化并記錄數據，結果見表4。測定結果其RSD 為1.18%，說明該藥品溶液在12h 內穩定。

表4 穩定性試驗結果

3.6.2 精密度試驗: 精密吸取供試品溶液5.0mL 到10mL的容量瓶中，定容，在最大波長處測定其吸光度，平行測定6 份，結果見表5。測定結果其RSD 為0.58%，說明實驗精密度良好。

表5 精密度試驗結果(n=6)

3.6.3 重現性試驗: 對同一批樣品分別制備樣品供試液，測定并計算咖啡因含量，結果見表6，RSD 為1.67%。表明同批樣品經多次測定，重現性良好。

表6 重現性試驗結果(n=5)

3.6.4 回收率試驗: 精密稱取已知咖啡因含量的山茶花細粉(同一批次)0.5g，6 份，分別加入咖啡因標準品適量，按“3.5”方法平行制備。測定結果見表7。平回收率為100.9%，RSD 為1.06%，在有效范圍內，說明該實驗回收率較高［3］。

表7 加標回收率結果(n=6)

3.7 含量測定: 稱取山茶花粉末約1.0g，精密稱定。按“3.5 供試品溶液的制備”方法制備溶液，在測定波長處進行含量測定，依該法分別對3 批山茶花藥材進行含量測定，得出的數據見表8。

表8 不同批次樣品溶液的吸光度及咖啡因含量

3 討 論

本試驗所用山茶花已經確定含有咖啡因，對照品和供試品都在273nm 波長處有最大吸收，與文獻基本一致［4］，所以確定供試品在273nm 的吸收峰為咖啡因的吸收峰。咖啡因在溫度大于100℃時具有升華的性質［5］，所以對于試驗溫度應控制在100℃以下，所以參考文獻選擇了85℃，90℃，95℃三個溫度進行正交試驗，并通過試驗確定最優溫度為95℃。在對供試品溶液進行光譜掃描所得的曲線峰值均為268 ～274nm，說明干擾雜質已基本除去，不影響峰形，保證了檢測結果的準確性。

本實驗對山茶花中咖啡因的提取方法進行了研究，通過正交試驗確定其最佳的提取條件，用此最優條件提取山茶花種的咖啡因進行含量測定實驗，確定山茶花中咖啡因的含量。同時進行一系列的檢測性試驗，如精密度試驗、重現性試驗、穩定性試驗及加樣回收率實驗，以確定此次試驗的精確度及準確度。

山茶花作為民族民間藥材可用于燙傷、止血與涼血作用［6］。而適量的咖啡因具有興奮利尿作用，臨床上用作利尿劑、強心劑和復醒劑，同時也是配制復方乙酰水楊酸和氨非咖片等的主要原料。本次試驗對山茶花提取方法及咖啡因含量進行了測定，為深度開發山茶花藥材資源提供依據。

［1］李斌，羅永明. 山茶屬植物化學成分及生物活性研究［J］.江西中醫學院學報，2000，12(1): 44 -47.

［2］江蘇新醫學院. 中藥大辭典［M］. 上海: 上海科學技術出版社，2000.

［3］劉臣，唐長波，姚麗萍，等.高效液相色譜法測定碧螺春茶葉中的咖啡因含量［J］. 江蘇農業學報，2012，28(4): 877 -879.

［4］楊言言，張鐵銘.紫外分光光度法測定安徽羅漢尖老茶中咖啡因含量［J］.安徽中醫學院學報，2012，31(3): 72-73.

［5］徐鳳英.茶葉中咖啡因提取方法與工藝［J］. 寧夏農林科技，2012，53(11): 102 -103.

［6］任全進，于金平.止血涼血山茶花［J］. 植物與保健(冬末版)，2009.54 -55.