高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米及植株中胺唑草酮及其代謝物

董茂鋒+白冰+唐紅霞+王偉民+趙志輝+韓錚+宋衛(wèi)國

摘 要 建立了同時測定玉米及玉米植株中胺唑草酮及其兩個代謝物殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品采用乙腈提取，石墨化炭黑（GCB）和C18分散固相萃取凈化，以甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。在1～1000 μg/L的濃度范圍內(nèi)，3種目標化合物的響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，在3個添加水平下，玉米籽粒及植株中胺唑草酮及其代謝物的平均添加回收率為85%～111%，相對標準偏差（RSD）為2.3%～11.0%。方法定量限（LOQ）為5 μg/kg。采用本方法監(jiān)測15例市售玉米樣品，樣品中目標物均低于方法檢出限。本方法簡單，快速，靈敏度高，可完全滿足國外胺唑草酮相關(guān)現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

關(guān)鍵詞 胺唑草酮； 代謝物； 玉米； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

胺唑草酮（Amicarbazone， AMZ）是由美國拜耳公司研發(fā)，旨在取代高劑量除草劑防治雙子葉闊葉雜草的一類三唑啉酮類除草劑，主要適用于防治玉米、甘蔗等作物中的闊葉雜草，對野莧、藜、甘薯屬等雜草具有優(yōu)良防治效果【1】。其觸殺性和特效性決定了它具有較寬的施藥適期，可以方便地選擇種植前或芽前土壤使用，而作為新型低毒農(nóng)藥，其突出的除草效果表現(xiàn)為其用藥量大約僅為阿特拉津的1/3～1/2【2】。胺唑草酮毒理學數(shù)據(jù)證實了其是一類低毒農(nóng)藥，無致畸、致癌、致突變作用與再生毒性【3】。目前全球只有美國對胺唑草酮制定了最大殘留限量標準，限量標準涉及牛肉、豬肉、牛奶、羊及其相關(guān)內(nèi)臟等畜產(chǎn)品和大豆、小麥、棉花等作物，限量范圍在0.01～5.0 mg/kg，其中對于玉米的最大殘留限量涉及玉米植株（飼料用途）和玉米顆粒，分別為0.8和0.05 mg/kg【4】。根據(jù)美國EPA對胺唑草酮的殘留定義，胺唑草酮殘留應(yīng)包括胺唑草酮及其代謝物DA（N-（1，1-dimeth-ylethyl）-4，5-dihydro-3-（1-methylethyl）-5-oxo-1H-1，2，4-triazole-1-carboxamide）和ISO（N- （1，-dimethylethyl）-4，5-dihydro-3-（1-hydroxy-1-methylethyl）-5-oxo-1H-1，2，4-triazole-1-carboxamide），相關(guān)化學結(jié)構(gòu)式見圖1【4】。針對胺唑草酮即將在中國玉米種植中大量使用的預期，以及EPA關(guān)于胺唑草酮在玉米、玉米植株的殘留限量定義，建立玉米中胺唑草酮及其代謝物的分析方法具有重要意義。但是，目前關(guān)于胺唑草酮的殘留分析方法鮮有報道。2014年，Peixoto研究了不同光化學條件對胺唑草酮在水中降解的影響，結(jié)果顯示DA是其在水中降解的主要產(chǎn)物之一，同時分析胺唑草酮及其代謝物十分必要。

目前，QuChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）方法已成為農(nóng)藥殘留分析常用的凈化方法之一，其以簡單、快速、準確的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于谷物、蔬菜、水果和環(huán)境樣品中的農(nóng)藥殘留分析【5～18】。QuChERS方法的最大優(yōu)點在于可以通過分散固相萃取和提取溶液的優(yōu)化實現(xiàn)對不同基質(zhì)和不同化合物的凈化。本研究對QuChERS方法進行了改進，加水濕潤樣品后使用乙腈提取，以石墨化炭黑（GCB）和C18代替乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）對樣品進行分散固相萃取凈化。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米籽粒、鮮玉米及玉米植株中胺唑草酮及其代謝物DA和ISO的殘留分析方法，為胺唑草酮的分析檢測及相關(guān)市場監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（日本Shimadzu公司）； EC-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm， 2.7 μm，美國Agilent公司）； MX-F渦動混合器（中國Dragonlab公司）； 5415D離心機（德國Eppendorf公司）； GCB（Graphitized carbon black，石墨化炭黑， 40～100 μm ）、C18（40～60 μm）、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，40～60 μm）、0.22 μm有機濾膜（天津艾杰爾公司）； 乙腈和甲醇為色譜純（美國Merck公司）； NaCl、無水MgSO4、甲酸和乙酸銨均為分析純（上海化學試劑公司）； 水由Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

胺唑草酮、DA和ISO標準品（日本Arysta LifeScience公司）。準確稱取標準品并用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標準儲備液。玉米樣品購自當?shù)厥袌觥?/p>

2.2 樣品制備

將鮮玉米的籽粒剝下，將玉米植株切成小段，分別用食品加工器粉碎混勻，取約500 g作為待測樣品；將玉米籽粒用研磨器粉碎并過20目篩，混勻后取約500 g作為待測樣品。

2.2.1 鮮玉米及玉米籽粒處理 稱取經(jīng)過勻質(zhì)的鮮玉米或玉米籽粒樣品5.0 g（精確至0.01 g）至25 mL聚丙烯離心管中，依次加入5 mL水、10 mL乙腈、1 g NaCl和3 g無水MgSO4，渦旋提取3 min。以3000 r/min離心5 min，取1 mL上清液至裝有50 mg GCB、50 mg C18和150 mg無水MgSO4的2 mL離心管內(nèi)，渦旋1 min。以8000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后待測。

2.2.2 玉米植株處理 稱取經(jīng)過勻質(zhì)的玉米植株樣品2.5 g（精確至0.01 g）至 25 mL聚丙烯離心管中，依次加入10 mL水、10 mL乙腈、1 g NaCl和3 g 無水MgSO4，提取和凈化步驟同2.2.1節(jié)。

2.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件

流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min，10% B；1.5～2.0 min，10%～90% B； 2.0～6.0 min， 90% B。 柱溫40 ℃；進樣量5 μL。endprint

電噴霧電離源（ESI）正離子模式檢測；加熱模塊溫度400℃；霧化氣流量1.5 L/min （N2，99.99%）；干燥氣流量15.0 L/min （N2，99.99%）；離子源電壓3.5 kV；去溶劑化（Desolvation line，DL）溫度250 ℃； 碰撞誘導解離（Collision induced dissociation，CID）氣壓230 kPa （Ar，99.999%）。3種化合物的質(zhì)譜測定參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了正、負離子掃描模式對3種化合物的響應(yīng)。結(jié)果表明，正離子模式下，3種化合物的響應(yīng)值明顯高于負離子掃描模式。

在流動相中添加乙酸銨或甲酸是改善色譜峰形、提高儀器響應(yīng)值和離子化效率的常用有效手段。通常采用酸性流動相有利于質(zhì)譜正離子模式檢測，而甲酸是在正離子模式下最為常用的試劑之一【6，8，12】。以AMZ和DA的濃度為100 μg/L、ISO的濃度為200 μg/L為實驗條件，

圖2 流動相對目標化合物色譜峰面積的影響（A： 甲醇-水； B： 甲醇-0.5%甲酸； C： 甲醇-5 mmol/L乙酸銨）

Fig.2 Effect of mobile phase on target compounds （A： Methanol-water； B： methanol-water consisted of 0.5% formic acid； C： methanol-water consisted of 5 mmol/L ammonium acetate）首先比較了甲醇-水（A）和甲醇-0.5%甲酸溶液（B）兩種流動相對3種化合物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，3種化合物在甲醇-水流動相中比在甲醇-0.5%甲酸流動相中獲得了更高的峰面積（圖2）。其次比較了甲醇-水（A）和甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（C）兩種流動相對3種化合物響應(yīng)的影響。ISO在兩種流動相條件下峰面積無明顯變化，但AMZ和DA在甲醇-5 mmol/L乙酸銨流動相中，峰面積更大。故最終確定甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液作為分離3種化合物的流動相。

3.2 前處理方法優(yōu)化

通過加水使樣品膨脹濕潤是QuEChERS方法萃取低含水量樣本的常用手段，如谷物【10，17】、茶葉【11】、土壤【8】。玉米籽粒和玉米植株含水量較少，為驗證樣品提取時加水的提取效果，分別稱取鮮玉米和玉米籽粒5 g、玉米植株2.5 g（玉米植株含較多纖維，密度小，故稱取2.5 g），加5 mL水潤濕后，使用10 mL乙腈渦旋提取，按2.2和2.3節(jié)所述步驟進行樣品凈化和測定。結(jié)果顯示，鮮玉米和玉米籽粒中，3種化合物的回收率均在89%～109%之間，符合農(nóng)藥殘留分析方法要求。玉米植株中，AMZ、DA和ISO的回收率分別介于89%～105%， 75%～81%和62%～78%之間，DA和ISO的回收率明顯偏低（表2）。為避免由于提取溶劑增加導致方法檢出限提高，考慮通過增加加水量而不改變提取溶劑乙腈的體積，改善玉米植株中化合物的回收率。實驗結(jié)果表明，當稱取2.5 g玉米植株，植株樣品加水10 mL潤濕10 mL乙腈渦旋提取時，DA和ISO的回收率均有明顯改善，3種化合物的平均回收率和相對標準偏差分別為90.9%～111.0%和3.2%～6.3%（表4）。綜上所述，通過樣品中加水潤濕樣本，且根據(jù)不同基質(zhì)調(diào)整合適的加水量，對3種目標化合物的準確測定具有明顯的提高，因此確定采用5 mL水潤濕鮮玉米和玉米籽粒樣本后（玉米植株樣本稱取2.5 g，加水10 mL），加入10 mL乙腈提取作為提取方法。

3.3 吸附材料的選擇

QuEChERS方法的原理是通過乙腈萃取，結(jié)合分散固相萃取凈化，實現(xiàn)樣品中化合物的提取及雜質(zhì)的去除。其中吸附材料是影響分散固相萃取凈化效果和保證方法準確度和精密度的最主要因素。鑒于C18，GCB和PSA是應(yīng)用最為廣泛的分散固相萃取吸附材料【5，6，8～13】，本實驗考察了這3種吸附材料（用量均為50 mg）對3種目標物標準溶液的吸附情況（標準溶液濃度均為100 μg/L）。結(jié)果表明，雖然PSA對AMZ和DA無明顯吸附作用（回收率分別為96%和80%），但其對ISO具有明顯吸附作用（回收率為41%），而C18和GCB對3種化合物均無明顯吸附作用（回收率為102%～119%）。為了保證方法的準確度，最終確定了50 mg GCB、50 mg C18和150 mg無水MgSO4作為方法的凈化材料。

3.4 線性相關(guān)、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)

配制1～1000 μg/L系列基質(zhì)匹配標準工作液，以化合物的峰面積（y）對化合物的濃度（x，μg/L）繪制基質(zhì)標準曲線。由表2可知，3種化合物在1～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9929～0.9995）。按3倍信噪比（S/N）計算玉米籽粒、鮮玉米和植株中AMZ、DA和ISO的檢出限（LOD）為0.1～1.0 μg/kg。

國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會（IUPAC）定義基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的其它成分對待測物測定值的綜合影響【19】。影響基質(zhì)效應(yīng)的因素主要由分析儀器、樣品基質(zhì)、前處理手段等組成【12】。本實驗通過繪制溶劑標準溶液線性曲線和基質(zhì)匹配標準溶液線性曲線，計算和評價方法基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)以η表示： η=（基質(zhì)匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）/溶劑標準曲線的斜率，若|η|<10%，說明無明顯基質(zhì)效應(yīng)；反之則說明具有明顯基質(zhì)增強或減弱效應(yīng)【13】。由表3可知，η在-65%～-12%之間，3種化合物均具有明顯的基質(zhì)減弱效應(yīng)，說明在對3種化合物定量時需選用基質(zhì)匹配標準曲線定量消除基質(zhì)效應(yīng)影響。通過比較基質(zhì)標準曲線和未凈化的基質(zhì)標準曲線，以基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)對方法的凈化效果進行了評價。結(jié)果表明，通過凈化后，3種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)的絕對值下降了endprint

表3 3種化合物的溶劑線性方程，未凈化和凈化后的基質(zhì)線性方程，相關(guān)系數(shù)，基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)和檢出限

0.8“a”表示基質(zhì)標準曲線由未經(jīng)過分散固相萃取凈化的基質(zhì)配制，“b”表示基質(zhì)標準曲線由經(jīng)過分散固相萃取凈化的基質(zhì)配制。

“a” means the matrix-matched calibration curves without purification by dispersive solid phase extraction， “b” means the matrix-matched calibration curves with purification by d-SPE.

4.7%～22.4%，表明方法確定的前處理凈化方式具有明顯的凈化效果，適用于玉米籽粒、鮮玉米和玉米植株3種基質(zhì)。

3.5 方法準確度和精密度

對玉米籽粒、鮮玉米和玉米植株樣品中添加一定濃度的AMZ、DA和ISO標準溶液并靜置30 min后，按2.2和2.3節(jié)所述步驟進行樣品凈化和測定，表4為3個不同添加水平的平均回收率和相對標準偏差。3種化合物的平均回收率為85%～111%，日內(nèi)相對標準偏差（RSDr）為2.3%～9.1%，日間相對標準偏差（RSDR）為3.1%～11.0%，以上結(jié)果均滿足歐盟關(guān)于農(nóng)藥殘留分析方法和我國關(guān)于農(nóng)藥殘留分析方法的要求【20】。以最小添加水平表示方法的定量限，本方法中胺唑草酮、DA和ISO的定量限為5 μg/kg，遠均低于EPA關(guān)于玉米中胺唑草酮的限量要求。表4 AMZ，DA和ISO在玉米和玉米植株中的添加回收率（n=10，%），日內(nèi)相對標準偏差（RSDr，%）和日間相對標準偏差（RSDR，%）

3.6 方法應(yīng)用

為驗證本方法的適用性和實用性，應(yīng)用本方法對本地市售15份玉米籽粒樣本進行監(jiān)測，檢測結(jié)果表明，樣本中胺唑草酮及其代謝物的含量均低于方法檢出限。實驗結(jié)果表明， 本方法具有準確、簡單、靈敏、快速等優(yōu)點，能有效滿足玉米樣本中胺唑草酮的殘留測定要求，為胺唑草酮的殘留分析及市場監(jiān)測提供一種可靠的分析方法。

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