木香烴內酯誘導乳腺癌MCF—7細胞凋亡作用機制的研究

王桂明　史棟棟　彭章曉　魯陽芳　谷雪　王彥++閆超

摘 要 研究了木香烴內酯誘導人乳腺癌細胞MCF-7細胞凋亡的作用機制。采用流式細胞儀測定不同濃度木香烴內酯（0， 2， 4， 8 μg/mL）作用于MCF-7細胞后細胞凋亡、活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量及線粒體跨膜電位（Mitochondrial transmembrane potential， MTP）的變化，氣相色譜-質譜聯用（GC-TOF/MS）技術分析加藥組與未加藥組的代謝差異物。結果表明，木香烴內酯能誘導MCF-7細胞凋亡，并具有濃度依賴性，能夠促使ROS含量升高； MTP在2 μg/mL木香烴內酯作用時升高，在4和8 μg/mL時顯著下降；基于GC-TOF/MS的細胞代謝組學研究，最終發現15種代謝差異物。基于上述結果，推測木香烴內酯通過引起ROS含量升高、MTP降低，擾亂線粒體的正常功能，進一步阻礙TCA循環，抑制ATP合成，擾亂了細胞內代謝物的平衡，并引起位于膜間隙的凋亡相關蛋白釋放，最終導致MCF-7細胞的凋亡。

關鍵詞 MCF-7細胞； 細胞凋亡； 細胞代謝組學； 活性氧； 線粒體跨膜電位

1 引 言

乳腺癌嚴重威脅著女性健康，居于女性腫瘤患者致死率的第2位，發病率在發展中國家呈逐年上升趨勢【1】。木香烴內酯是從中藥木香中提取的倍半萜內酯，研究發現其具有抗炎等生物活性【2～4】，可誘導早幼粒白血病HL-60細胞及U937細胞、乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡【5～7】，對正常細胞無毒性。它可以通過引起ROS的升高、MTP的崩潰誘導膀胱癌細胞的凋亡【8】，研究表明，其通過與微管蛋白作用、抑制端粒酶活性等抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖【9，10】。腫瘤細胞內ROS的含量比正常細胞高，在以ROS為靶點的藥物作用下腫瘤細胞內ROS首先達到氧化應激狀態，因此可有選擇性地殺死癌細胞【11】。MTP的降低可以引起腫瘤細胞的凋亡，ROS含量升高可以引起線粒體通透性轉運孔的打開而引起MTP降低，最終促進細胞凋亡【12】。因此，ROS升高、MTP的降低與細胞凋亡之間存在密切聯系。

代謝組學被稱為“基因型和表型之間的橋梁”【13】，不僅可以測定藥物本身的代謝及藥代動力學變化，還可以測定藥物作用引起的內源性代謝產物的變化【14，15】。因此，將代謝組學與傳統生物學研究方法相結合，對于深入探究藥物作用機制有重要的意義。

目前，代謝組學結合傳統生物學的方法考察藥物抑制腫瘤細胞增殖作用的研究已有文獻報道【16】，但是將此方法用于細胞凋亡作用機制方面的研究仍未見報道。本研究以木香烴內酯作用于MCF-7細胞，基于細胞內ROS含量以及MTP的變化，結合氣相色譜-質譜聯用（GC-TOF/MS）技術分析藥物作用前后細胞內代謝產物的變化，探討了木香烴內酯誘導MCF-7細胞凋亡作用的機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CO2培養箱，氮吹儀（Thermo， USA）；低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；LSRFortessa流式細胞儀、 FACSCalibur流式細胞儀（BD， USA）；GC×GC-TOF/MS （LECO， USA）；FS-150PV超聲細胞破碎儀 （上海生析超聲儀器有限公司）。木香烴內酯（純度>98%，上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清、DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（美國賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck）；吡啶（分析純）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）均購于國藥集團化學試劑有限公司；N， O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1%三甲基氯硅烷）、甲氧胺、2-氯-苯丙氨酸均購于美國Sigma公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、羅丹明123（Rhodamine123）、2′， 7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）均購于碧云天生物技術研究所。

2.2 細胞凋亡分析

用DMSO配制10 mg/mL木香烴內酯儲備液，用培養基逐步稀釋至8， 4 和2 μg/mL（DMSO終濃度<0.1%）。用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒測定細胞凋亡情況。試劑盒中具有Annexin V-FITC與碘化丙啶（PI）兩種染料。磷酯酰絲氨酸（PS）主要分布在細胞膜內側，凋亡細胞的PS外翻，Annexin V與PS結合；凋亡晚期及壞死細胞的細胞膜完整性受到破壞，PI可以進入細胞內進行標記，Annexin V-FITC可以進入壞死細胞內與位于內側的PS結合而標記。

指數生長期的MCF-7細胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養12 h后，隨機分4組，每組3個平行，分別加入以下各組藥物：Control（0 μg/ml）， 2， 4和8 μg/mL，培養24 h后，收集細胞，用冷PBS緩沖溶液清洗2遍，加入200 μL凋亡結合液后用移液槍輕輕吹散細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI避光孵育15 min，FACSCalibur流式細胞儀檢測10000個細胞。

2.3 細胞內ROS含量的測定

用熒光探針DCFH-DA測定ROS的含量。DCFH-DA本身沒有熒光，進入細胞后可最終被ROS氧化為有熒光的2′，7′-二氯熒光黃（DCF），其熒光強度代表細胞內ROS的水平。將處于指數生長期的MCF-7細胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養12 h后，隨機分4組，每組3個平行，分別加入木香烴內酯2， 4 和8 μg/mL和空白培養基。培養24 h后，棄去培養基，用含8 μmol/L DCFH-DA無血清培養基37 ℃避光孵育20 min，PBS清洗2遍以除去未標記的DCFH-DA探針，收集細胞用LSRFortessa流式細胞儀分析，檢測10000個細胞。

2.4 線粒體跨膜電位（MTP）的測定endprint

Rhodamine123是一種攜帶正電荷的陽離子染料，可依賴較高的負線粒體跨膜電位有選擇性的進入線粒體，其熒光強度高說明線粒體內電負性強，MTP高，反之則MTP低。將處于指數生長期的MCF-7細胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養12 h后，隨機分4組，每組3個平行，加入木香烴內酯（2， 4 和8 μg/mL）、空白培養基。培養24 h后，Rhodamine123（0.2 μmol/L）避光染色30 min，用冷PBS緩沖溶液清洗2遍，收集細胞，LSRFortessa流式細胞儀測定其熒光強度。

2.5 基于GC-TOF/MS的細胞代謝組學研究

2.5.1 細胞代謝物的提取及衍生化 將處于指數生長期的細胞接種在100 mm×20 mm的培養皿中（3×106/皿），培養12 h后加入木香烴內酯（6 μg/mL）、含等量DMSO的培養基，設6個平行。細胞的提取及衍生化過程如下【17】：培養24 h后，棄去培養基，用生理鹽水清洗3遍，液氮迅速猝滅。每個培養皿加入1000 μl甲醇-水（4∶1， V/V）溶液，刮取細胞至樣品瓶中，為更充分提取細胞，每個樣品加入200 μL氯仿。每一樣品加入10 μL 2-氯-苯丙氨酸（內標，0.3 mg/mL），渦旋，超聲破碎（3 min，5 s開，5 s關，4 ℃）細胞提取代謝物。

將提取后的細胞樣品4000 r/min離心10 min，取1000 μL上清液至GC進樣瓶中，室溫真空干燥，用氮氣再次吹干后，加入80 μL甲氧胺（15 mg/mL，吡啶配制），混合1 min，30 ℃反應90 min后，加入80 μL BSTFA和40 μL正己烷，70 ℃下反應90 min。

2.5.2 GC-TOF/MS條件 DB-5 MS色譜柱（30 m × 250 μm I.D.， J&W Scientific， Folsom， CA）； 載氣： 高純氦氣，流速1.0 mL/min。程序升溫： 起始溫度80 ℃，保持0.2 min；以10 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至290 ℃，保持11 min。進樣口溫度280 ℃，接口溫度270 ℃，EI源溫度220 ℃，電子碰撞能量70 eV。

質量掃描范圍： m/z 30～600全掃描，質譜圖采集速度：每秒20 幅。

2.5.3 GC-TOF/MS數據分析 GC-TOF/MS得到的原始數據經ChromaTOF（v 4.50， LECO， St Joseph， MI，USA）軟件進行預處理，得到包括樣品信息、保留時間及峰面積等信息的CSV三維數據矩陣，扣除已知的假峰后對數據進行峰面積歸一化，然后導入SIMCA-P 11.5軟件進行多維統計分析。本實驗主要進行無監督的主成分分析（PCA）和有監督的正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。PCA分析主要觀察樣本的總體分布，OPLS-DA來區分加藥組與對照組之間的代謝差異物。變量權重值（Variable importance in the projection， VIP）>1的代謝物被認為是差異代謝物，同時結合t檢驗及Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗驗證差異性代謝物，最后將得到的代謝差異物進行NIST庫搜索。

3 結果與討論

3.1 木香烴內酯對MCF-7細胞凋亡的影響

研究木香烴內酯對MCF-7細胞的凋亡作用，流式細胞儀檢測各組凋亡率，圖1A是其中一組凋亡實驗的散點圖，①②③和④分別代表細胞碎片、后期凋亡細胞、活細胞、前期凋亡細胞；圖1B是對3次平行實驗進行分析的結果，從圖可以看出隨著藥物作用濃度的升高，MCF-7細胞的前期凋亡、后期凋亡及總凋亡率逐漸升高（在2 μg/mL處前期凋亡率略降低，但是與對照組沒有顯著性差異）。由此可知，

3.2 木香烴內酯對MCF-7細胞線粒體跨膜電位（MTP）的影響

MTP的崩潰能引起細胞凋亡【18】。為探究木香烴內酯誘導MCF-7細胞凋亡的作用機制，本研究考察了其對MCF-7細胞MTP的影響。由圖2可見，與對照組相比，在2 μg/mL木香烴內酯作用下MTP升高，在4和8 μg/mL時顯著下降，且隨著濃度的升高而下降。文獻＼表1 基于GC-TOF/MS數據的MCF-7細胞木香烴內酯組與對照組對比的代謝差異物代謝差異物中，檸檬酸含量下降、琥珀酸含量上升，可能是由于細胞內ROS含量的升高及MTP的降低破壞了三羧酸循環（TCA）而造成的。已有研究表明，氧化應激與TCA循環功能性障礙相關，ROS可促使α-酮戊二酸轉化為琥珀酸【21】。琥珀酸脫氫酶可催化琥珀酸轉化為延胡索酸，是TCA循環中唯一與線粒體內膜結合的酶。在上述研究中，MTP降低，琥珀酸脫氫酶活性可能受到抑制，使琥珀酸的含量升高。

線粒體是ATP合成的主要場所，MTP的降低，使氧化磷酸化過程解耦聯，ATP水解大于合成，破壞了離子和代謝物平衡【22】。TCA循環是糖類、脂肪和蛋白質最終氧化的重要酶促循環反應系統。在正常情況下，糖酵解、TCA循環的速度以及氧化磷酸化的速度是相互協調的【23】。在上述研究中，MTP降低，使氧化磷酸化過程解耦聯，抑制了ATP的合成。因此，推測TCA循環受到抑制，進而抑制了糖酵解過程，使葡萄糖、山梨糖的含量升高。核糖醇是組成核黃素的成分之一，核黃素在生物體內以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式參與氧化呼吸鏈、TCA循環。因此推測，氧化呼吸鏈以及TCA循環受到抑制后，引起核糖醇的含量升高。氨基酸可通過脫氨基作用生成α-酮酸參與到TCA循環中，其中苯丙氨酸、酪氨酸可轉化為延胡索酸，谷氨酸可轉化為α-酮戊二酸，絲氨酸、甘氨酸可轉化為丙酮酸【23】，谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸含量下降，絲氨酸、甘氨酸含量升高可能是由木香烴內酯抑制了TCA循環進而引起了氨基酸代謝的紊亂而造成的。endprint

4 結 論

以細胞代謝組學和傳統生物學方法為基礎，探究了木香烴內酯作用于MCF-7細胞后，細胞內ROS含量、MTP及細胞內代謝產物的變化。結果表明，木香烴內酯作用于乳腺癌MCF-7細胞后，使ROS含量升高，MTP降低，導致線粒體的結構受到破壞，可能進一步阻礙了TCA循環，抑制了ATP合成，擾亂了細胞內代謝物的平衡，并引起位于膜間隙的凋亡相關信號的釋放，最終導致MCF-7細胞的凋亡。本研究不僅從代謝組學的角度為研究木香烴內酯抗腫瘤的作用機制提供了新線索，而且進一步表明基于GC-TOF/MS的細胞代謝組學方法可以作為研究藥物作用機制的有效分析工具。

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