固相萃取—高效液相色譜法測定焦糖色素中副產物2—甲基咪唑、4—甲基咪唑和2—乙酰基—4—（1，2，3，4—四羥基丁基）咪唑

榮維廣 宋寧慧 阮華 吳建 馬永建 吉文亮 劉華良

摘 要 建立了固相萃取法結合高效液相色譜同時檢測焦糖色素中2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）的方法。樣品經加水渦旋提取后，經混合型強陽離子交換固相萃取小柱富集凈化，以乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）為流動相，流速為0.6 mL/min，用反向色譜柱Polaris C18-A （250 mm×4.6 mm，5 μm）柱分離，分別在二極管陣列檢測器215 nm波長條件下檢測焦糖色素中的2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和287 nm波長條件下檢測2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑的含量。2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑在0.2～20 mg/L之間線性關系良好（r>0.9996），在10， 25和100 mg/kg添加濃度的回收率范圍為75.3%～93.4%，相對標準偏差均小于10%，檢出限分別為為2.6， 3.0和1.5 mg/kg，定量限分別為8.5， 10.0和5.0 mg/kg。

關鍵詞 高效液相色譜法； 焦糖色素； 2-甲基咪唑； 4-甲基咪唑； 2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑

1 引 言

焦糖色素是一種食品添加劑（俗稱醬色），是一種濃紅褐色的膠體物質，占整個食品著色劑銷量的90%以上【1】。可應用于醬油、醋、醬菜、啤酒、罐頭、糖果、湯料、焙烤食品、烤煙及止咳糖漿等各個方面【2】。在焦糖色素的形成過程中主要發生兩大類反應——美拉德反應和焦糖化反應【3】，其中普通焦糖色素的生產過程中主要發生焦糖化反應，生產過程中加入氨（銨）催化劑的焦糖色素生產以美拉德反應為主。研究發現，美拉德反應過程中能夠產生許多對人體有害的化學物質【4】，如2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）。2-MEI 和4-MEI作為神經毒素，具有強烈的致驚厥作用，美國國家毒品管理計劃和其它研究者已經有明確的毒理學數據證明其具有致癌的風險【5～8】。2011年，國際腫瘤研究機構（IARC）將甲基咪唑類化合物認定為2B類致癌物【9】，而THI可引起免疫毒性【10，11】。鑒于咪唑類化合物的毒性，歐盟委員會已經對Ⅲ類焦糖色素中THI和4-MEI建立了限量規定，分別為10和200 mg/kg【12】。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的檢測方法對保證焦糖色素的品質，乃至使用焦糖色素著色的包括食品在內的眾多產品的品質尤其重要。

焦糖色素是一種黑褐色粘稠液體或固體，基質復雜。去除大量基質的干擾成為準確分析微量及痕量目標物的關鍵。目前，針對焦糖色素中4-MEI含量的測定，我國唯有食品添加劑焦糖色衛生標準GB8817-2001【13】，采用薄層法測定，而對于2-MEI和THI的測定尚無國家標準，也沒有限量規定。近年來，國內僅見2-MEI和4-MEI的檢測方法的報道【3，13～16】，對于THI檢測方法研究尚未見報道； 已建立的焦糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的檢測方法所采用前處理方法主要有：柱層析【14，15】、液液萃取【16】、離子對萃取【17】、固相萃取【18，19】等。柱層析、液液萃取、離子對萃取操作繁瑣，不適合大批量樣品分析，且這些前處理方法用于THI提取凈化的報道較少。3種目標物的的檢測方法主要有薄層色譜法【13】、氣相色譜法【14】、液相色譜法【16】、離子色譜法【19】、毛細管電泳法【20】、氣相色譜-質譜聯用技術【15】和液相色譜-質譜聯用技術【18，21】。其中的方法大多數都只能檢測2-MEI、4-MEI或THI中的1種或2種物質。

本研究建立了一步固相萃取同時富集焦糖色素中3種目標物2-MEI、4-MEI和THI，HPLC同時檢測的方法。與已報道的液相色譜方法相比，本方法的檢出限更低，線性范圍更寬，操作更簡單，準確度更高； 與已報道的液-質聯用技術相比檢出限相當，操作簡單，分析成本更低，適合于對焦糖色素中2-MEI、4-MEI與THI同時檢測分析。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與試劑

1200 高效液相色譜儀（光電二極管陣列檢測器（DAD），Agilent美國公司），全自動固相萃取儀（北京普立泰科儀器有限公司），氮氣濃縮儀（上海安譜科學儀器有限公司），渦旋快速混合器（姜堰市新康醫療器械有限公司），純水儀（美國Millipore）。水系微孔濾膜（0.22 μm，南京榮華科學器材有限公司）； Oasis MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國Waters公司）； PLEXA PCX（3 mL/60 mg，美國Agilent公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）； HCl（優級純，含量36%～38%，南京化學試劑有限公司）； 氨水為優級純（含量25%～28%，南京化學試劑有限公司）； 2-MEI、4-MEI和THI標準品（純度均≥99.0%，西格瑪公司）。

2.2 標準品和標準溶液的制備

標準貯備液：分別精確稱取2-MEI、4-MEI和THI標準品0.0125 g（精確至0.0001 g），用水分別溶解并定容至 25 mL，濃度均為0.5 g/L。貯備液置于4 ℃保存。

混合標準中間液：分別吸取 2 mL 的2-MEI、4-MEI和THI標準貯備液于10 mL容量瓶中，用水定容，混勻，其濃度分別為100 mg/L。endprint

標準工作溶液：分別吸取適量標準中間液（100 mg/L）于1.5 mL進樣瓶中，用流動相補足到1 mL。配制成2-MEI、4-MEI和THI的濃度分別為0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列混合標準溶液。

2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑

2.3 試樣制備 稱取焦糖色素樣品1 g（準確至0.01 g），加水超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中。取0.2 mL上述樣品溶液，加入0.1 mL 0.1 mol/L HCl，加水補足到2 mL，渦旋混勻后待固相萃取凈化。

2.4 樣品分析

2.4.1 固相萃取條件 將制備好的樣品溶液加入剛活化好的固相萃取小柱中（1 mL甲醇和1 mL水活化），上樣時控制流速小于0.5 mL/min，抽干，加入1 mL水和1 mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，用3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脫收集，控制流速小于0.5 mL/min，抽干。將收集液在低于50 ℃條件下，氮氣吹干，殘渣用1.0 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過0.22 μm水系微孔濾膜，濾液供HPLC測定。

2.4.2 液相色譜條件 色譜柱： Agilent Polaris C18-A色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）； 流速：0.6 mL/min； 柱溫：30 ℃； 進樣量：10 μL； DAD檢測器檢測波長：2-MEI和4-MEI為 215 nm； THI為287 nm。

3 結果與討論

3.1 流動相和流動相比例的優化

甲醇和乙腈是反相色譜中常用的溶劑，但甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度，而乙腈截止波長比甲醇低，更適合此次實驗所用的215 nm檢測波長，所以本研究選擇乙腈為流動相。

考察了乙腈比例分別為5%， 10%， 20%， 40%的情況對峰形的影響，結果在10%條件下峰形最好，故選擇流動相比例條件為乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）。

3.2 固相萃取條件的優化

3.2.1 固相萃取柱的選擇 比較了兩種陽離子交換SPE（Solid-phase extraction）柱：Waters Oasis MCX（3 mL，60 mg，Waters公司）和Agilent PLEXA PCX（3 mL，60 mg，Agilent公司）的萃取效率。采用2 mL的上液量（分別含有0.5， 2.0和10.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），過柱后分別以3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脫，氮氣吹干后檢測2-MEI、4-MEI和THI的含量； 與添加量作比較，得出2-MEI、4-MEI和THI在兩種類型固相萃取柱的回收率。由表1可知，2-MEI， 4-MEI和THI在Oasis MCX固相萃取柱上的萃取效率略好。

3.2.2 固相萃取上樣液酸度的優化 強陽離子交換固相萃取對上樣溶液的pH值有要求。本實驗比較了0.02和0.1 mol/L HCl溶液調節上樣溶液pH值：當使用0.02 mol/L HCl調節樣品pH值時，個別樣品pH值仍較高，可達到4.3，此類樣品的目標物的回收率及穩定性均稍差；而當使用0.1 mol/L HCl調節樣品pH值時，所有樣品pH<3.0，在此pH值下，在所有樣品中目標物的回收率及穩定性均稍好。因此，濃度選擇0.1 mol/L。

3.2.3 固相萃取洗脫溶劑及洗脫體積的優化

Klejdus等【18】在固相萃取研究中使用了甲醇-5 mol/L HCl（3∶1， V/V）作為洗脫溶液，該洗脫溶劑中由于存在較多水，不僅不容易揮干，并且大量存在的Cl

將腐蝕對儀器設備，這是該方法的致命缺點。本研究采用氨水-甲醇（5∶95， V/V）進行洗脫收集，方法準確度和精密度均能滿足要求。

固相萃取中上液量采用2 mL（分別含有5.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），過柱后以氨水-甲醇（5∶95， V/V）進行洗脫收集，每1 mL洗脫液單獨收集，共收集5次。氮氣吹干后檢測洗脫液中2-MEI、4-MEI和THI含量。由表2可見，用3 mL洗脫液洗脫已能得到滿意結果，最終確定洗脫溶液體積為3 mL。表2 不同體積洗脫液中2-MEI、4-MEI和THI的含量NDNDNDND： 未檢出 （Not detected）。

3.3 方法評價

3.3.1 方法的標準曲線、相關系數及線性范圍

在選定的色譜條件下測定混合標準工作液，得到2-MEI、4-MEI和THI的線性方程、相關系數和線性范圍。由表3可知，在0.2～20 mg/L 線性范圍內，2-MEI、4-MEI和THI均表現出良好的線性關系，相關系數均大于0.9996。圖1為2-MEI、4-MEI和THI標準品的色譜圖，圖2為典型焦糖色樣品中的2-MEI、4-MEI和THI添加回收色譜圖。

本研究根據3倍信噪比（S/N=3）得到2-MEI、4-MEI和THI的最低檢出濃度為0.05、0.06和0.03 mg/L。當稱樣為1 g時，經本研究確定的前處理方法處理后最終定容到1 mL檢測分析，得到2MEI、4-MEI和THI的檢出限分別為2.6， 3.0和1.5 mg/kg，根據10 倍信噪比（S/N=10）得到定量限分別為8.5， 10.0和5.0 mg/kg。方法的靈敏度能夠滿足食品添加劑焦糖色衛生標準GB 8817-2001【13】中規定的4-MEI限量的檢測要求及歐盟標準化委員會【12】規定的4-MEI 和THI限量的檢測要求。

3.3.2 方法的準確度和精密度 本方法設置10， 25和100 mg/kg 3個加標水平進行加標回收實驗，分別選取Ⅲ類焦糖色2份和Ⅳ類焦糖色2份，重復測定6次，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。2-MEI的平均回收率為80.4%～93.4%，4-MEI的平均回收率為80.2%～93.0%，THI的平均回收率為75.3%～84.6%，準確度均較好，相對標準偏差均小于10%，結果見表4。

3.4 實際樣品分析

采用本方法對從全國焦糖色素生產廠家和市場流通環節所采集的69份焦糖色素樣品，其中包括

20份Ⅲ類樣品和49份Ⅵ類樣品，分別檢測2-MEI， 4-MEI和THI，檢出情況見表5。2-MEI共有7份樣品檢出，均低于100 mg/kg，未包含在表5中； 4-MEI以食品添加劑焦糖色衛生標準GB8817-2001【13】規定的限量200 mg/kg判定，Ⅲ類和Ⅵ類焦糖色素中4-MEI的超標率分別為20%和18%； 對于THI我國尚無限量標準，根據歐盟標準化委員會【12】的規定Ⅲ類焦糖色素限量為10 mg/kg，Ⅲ類焦糖色素中THI的超標率為35%。

References

1 ZHANG Jin-Yun， ZENG Xiang-Yan. Chinese J. Modern Food Science and Technology， 2006， 22（3）： 67-69

張金云， 曾祥燕. 現代食品科技， 2006， 22（3）： 67-69

2 WANG Feng-Yun， PENG Yun-Long， LYU Jin-An， GU Jia-Shan. Chinese J. Chem. Educ.， 2013， 34（7）： 1-2

汪豐云， 呂金安， 顧家山. 化學教育， 2013， 34（7）： 1-2endprint