云南文山竹叢枝病的檢測及16S rDNA 片段序列分析

駱帝諭?王連春

摘 要：用植原體16S rRNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，對表現叢枝的竹子植株總DNA進行直接PCR及巢式PCR擴增，得到長1.2 kb的目的片段。經過克隆測序比較分析，結果表明其屬于16Sr I-B亞組。

關鍵詞：云南；竹叢枝；16s rDNA

竹是禾本科竹亞科Bambusoideae植物的總稱。竹子是具有極高的觀賞性的一種經濟作物，其形態優美，常作為景觀觀賞、道旁植被、公園植物[1]。云南文山州地處云貴高原東南部，屬于亞熱帶氣候，該地區水熱資源較豐富，年溫差小，日溫差大，比較適合竹子的生長。

竹叢枝病又名“掃帚病”，“竹簇葉病”，在韓國、印度以及中國許多省市均有報道[2-4]。感病植株生長勢弱，出筍減少，嚴重的病竹常常會枯死，竹材質量嚴重下降。隨著竹林面積迅速擴大，該病的危害越來越嚴重，已成為竹子上最常見的嚴重病害之一[1，5]。早期的研究認為竹叢枝病是有瘤座菌[Aciculosporium take Miyake，Balansia take（Miyake） Rlara]真菌引起的病害[6]。然而許多植物叢枝病均被證實由植原體引起，隨著分子生物學研究技術的進步，通過PCR擴增可以快速鑒定植物材料中是否含有病原，本研究采擬采用PCR技術對文山表現叢枝癥狀的竹子植株進行植原體分子檢測，并對擴增得到的16S rDNA片段進行克隆及測序，并與已知的竹叢枝植原體16S rDNA進行序列同源性比較，確定其植原體株系的分類地位，并初步比較其各株系間的差別。

1 材料與方法

1.1 材料來源與主要試劑

竹子材料采自云南文山州廣南縣冷水溝，海拔1200m。材料于-80℃保存備用。基因組DNA提取試劑盒來自百泰克生物技術有限公司，DNA Marker、Taq酶、Amp、IPTG等試劑購自北京金式金生物科技有限公司。pMD19-T購自寶生物TaKaRa。

1.2 材料總DNA提取

取材料0.5g，剪碎放于研缽中，加入液氮，研磨3-5次，直至成細粉狀。參照植物基因組DNA提取試劑盒的方法，提取植株總DNA干燥后溶于EB buffer溶液，于-20°C下冷凍保存備用。

1.3 PCR擴增

選用植原體16S rDNA通常用的引物P1/P7和R16F2n/R16R2進行巢式PCR擴增：25μL體系，10 x Easy Taq Buffer 2.5μL ，dNTP 2μL，引物各0.5μL，Easy Taq Polymerase 0.25μL，DNA 模板1μL。PCR反應程序：預變性94℃ 5min，變性溫度94°C 1min，復性溫度48°C 1 min，延伸溫度72°C 2 min，總共30次循環，總延伸10min。巢式擴增程序為：預變性94℃ 5min，變性溫度94°C 1min，復性溫度55°C 1min，延伸溫度72°C 1min 30 s，總共35次循環。擴增產物在1﹪瓊脂糖1×TAE緩沖系統中電泳，每孔加樣3uL，用凝膠成像系統觀察并拍照記錄。

1.4 PCR擴增產物的純化、克隆、酶切鑒定以及序列測定

在紫外透射儀上切下含目的PCR產物瓊脂塊，用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（昆明碩陽科技有限公司），瓊脂塊凝膠上回收目的片段，在含有IPTG和X-gal的LB篩選平板上挑取白色菌落搖菌培養12小時，提取重組質粒DNA ，經過酶切和跑電泳檢測之后，篩選出正確的質粒DNA經過克隆送去上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.5 16S rDNA核酸序列同源性比較和酶切位點分析

采用DNAMAN 6.0、MEGA5.0等生物軟件，分析所測序列的含量，將測定到的序列與植原體組中各個具有代表性植原體的 16S rDNA基因序列進行比較。

2 結果與分析

2.1 感病植株的癥狀表現

感病植株明顯表現為叢枝癥狀，枝條先端枝條簇生，簇生節間變短，分枝增多，叢生成鳥巢狀，葉片呈現黃化（圖1）。

圖1 感病植株叢枝癥狀圖

2.2 PCR擴增結果

感病植株通過液氮提取總DNA，經巢式PCR 擴增，結果獲得大小約1 200 bp 的16S rDNA 片段（圖2），片段大小與預期大小相符，而健康對照未出現特異擴增帶。說明該叢枝樣品中確有植原體存在。

圖2 PCR 電泳檢測圖（M：Maker； 1為健康植株；2，3 為巢式PCR擴增的兩個不同重復）

2.3 16S rDNA序列分析

將擴增到的1 200 bp左右大小的特異片段經割膠純化后，連接pMD19-T，轉入大腸桿菌DH5α，涂板后挑取重組克隆，經PCR驗證正確的克隆子送上海生工測序， 結果表明：16S rDNA 基因擴增片段含有1 246個核苷酸，G + C 的含量為47.11 % ，符合植原體基因組G + C含量。將本研究中所獲得分離物命名為bamboo witches-broom phytoplasma ，BWB-WS。從Genbank中調取竹子叢枝植原體11條序列，并選取Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A，Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078） 16S r I-B作為參照序列，Acholeplasma laidlawii（M23932）作為外群（表1），利用MEGA 5 生物軟件進行植原體16S rDNA序列進行核酸同源性比較，同源性比較結果表明該研究獲得的植原體與BWB-YA，BWB-TA 同源關系最近，為99.7%，與已報道的云南另外一個株系BWB3同源關系為99.2%。與海南的3個株系BWB-Hn1，Hn2，Hn3同源關系較遠，在 89.4～89.6%之間。經在線工具iphyclassifier

根據16S rDNA序列建立的系統進化樹 （圖2）表明：BWB –WS 和已經報道的竹叢枝韓國、楊凌、山東等8個株系聚在一簇，并且和參照序列Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078）聚類在一個大支，同屬16S r I-B 亞組，和參照序列Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A亞組的成員明顯區別開，和海南的3個株系不屬于同一個組。在地域上，除了海南3個株系屬于植原體16S r II-A 組外，本研究文山分離物和其他地區的無明顯地域差別。

圖2基于16S rDNA片段堿基序列建立的竹叢枝植原體系統進化樹

3 討論與結論

竹子叢枝病，在我國竹產區廣泛分布，且有不斷加重的趨勢。早期研究有認為瘤座菌確能引起竹類叢枝病，該竹子發病是否由真菌和植原體共同侵染引起，尚不得而知。本研究用分子生物學方面進一步證實了云南文山竹叢枝內植原體的存在，并初步確定了其分類地位。

我國邱并生、蔡紅、劉永光等對分別采自北京、廣東、云南、山東的鳳尾竹叢枝（femleaf hedge bamboo witchesbroom，FHBWB）、刺竹叢枝（chinese thorny bamboo witchesbroom，BwB）等竹子材料進行了植原體16S rDNA 片段擴增及RFLP分析，結果表明它們均屬于翠菊黃化（16S r I ）組。本文對采自云南的文山的竹叢枝植原體16S rRNA基因部分序列測定及比較結果也顯示該株系屬于16S r I組，與前面研究報道結果一致，這也表明，不同來源，不同品種的竹子上均可感染該組植原體，不受地域品種的限制。經在線分析工具iphyclassifier

該研究獲得的植原體分離物屬于16S r I-B亞組，本研究中的材料在云南文山地區尚屬首次發現。

參考文獻

[1] 梁惠凌，黃仕訓，蔣能等.廣西竹子主要病蟲害的發生和綜合防治對策[C].//第六屆生物多樣性保護與利用高新科學技術國際研討會論文集.2006.

[2] JUNG H Y，CHANG M U，LEE J T，et a1.Detection of “Candidatus phytoplasma asteris”associated with henon bamboo witchesbroom in Korea[J].J Gen Plant Pathol，2006，72（4）：261-263.

[3] 莊啟國，劉應高，潘欣等.四川斑竹叢枝病植原體檢測及16S rDNA片斷序列分析[J].四川農業大學學報，2005，23（4）：417-419，431.

[4] 劉永光.山東省桑萎縮、棗瘋病、竹叢枝及三種新植原體病害分子檢測與鑒定[D].山東農業大學，2009.

[5] 楊永剛，吳小芹.竹叢枝病病原研究進展[J].浙江農林大學學報， 2011，28（1）：144-148.

[6] 朱熙樵，黃煥華.竹叢枝病的研究I癥狀、病菌分離和接種試驗[J].林業科學，1988，24（4）：483-487.

作者簡介

駱帝諭（1990-），男，云南文山，本科生，研究方向：植物病理學。

王連春，玉溪師范學院資源與環境學院。