羥苯磺酸鈣對對比劑腎病大鼠腎的保護作用

于芬芬 季文萱 單文紅 孫艷 劉桂美 黃俊彥

近年來隨著放射影像學的快速發展和介入治療的廣泛應用，對比劑在臨床診療中的應用也越來越多，對比劑引起的對比劑腎病(contrastinduced nephropathy，CIN)也隨之逐年增多，已成為醫院獲得性腎功能不全的第3 位原因［1］。目前，CIN 的發病機制尚不明確，認為可能的機制有:血流動力學發生改變導致腎髓質缺血缺氧，對比劑對腎小管的直接毒性作用，活性氧產生增多導致氧化應激損傷，細胞凋亡，炎性因子等［1-2］。國內外許多研究表明，抗氧化劑可通過減少腎氧化應激對CIN 發揮保護作用［3-5］。羥苯磺酸鈣是一種微循環改善劑及抗氧化劑，廣泛應用于抗氧化治療。本實驗通過建立CIN 大鼠模型，檢測腎丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達及細胞凋亡情況，觀察氧化應激和細胞凋亡與CIN 的關系，并給予羥苯磺酸鈣干預，探討羥苯磺酸鈣在CIN 中的干預效果及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物選取體重為200 ～220 g 的清潔級、健康雄性Wistar 大鼠(購自山東魯抗實驗動物中心)。TUNEL 試劑盒購自Roche 公司，MDA、SOD、GSH-Px試劑盒購自R ﹠ D，吲哚美辛(indometacin，INDO)粉劑、N-硝基-L-精氨酸甲酯(N'-nitro-L-argininemethylesterhydrochloride，L-NAME)粉劑均購自美國Sigma 公司，76%泛影葡胺購自上海旭東海普藥業有限公司，羥苯磺酸鈣購自海南林恒制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIN 大鼠模型建立及分組 將84 只大鼠按照隨機數字表法分為3 組:假手術組(A 組)、模型組(B 組)和羥苯磺酸鈣干預組(C 組)，每組28 只。造模當天，B 組、C 組按文獻制備CIN 大鼠模型［6］并有所改進，具體方法如下:大鼠尾靜脈埋置留置針1 枚，每隔15 min 分別由大鼠尾靜脈注射INDO(10 mg/kg)、L-NAME(10 mg/kg)和76%泛影葡胺(10 ml/kg);A 組同樣方法注射等量的INDO、L-NAME及生理鹽水;C 組于造模前3 d 及造模當天給予羥苯磺酸鈣［100 mg/(kg·d)］［7］灌胃，A 組及B 組給予等量的生理鹽水灌胃。造模72 h 內A 組未見大鼠死亡，B 組有5 只大鼠死亡，C 組有1 只大鼠死亡。以應用對比劑48 h 或72 h 內血肌酸酐(Scr)較基礎水平升高≥25%為造模成功［1］。

1.2.2 標本收集 于造模后24 h、48 h、72 h 分批處死大鼠，每組每個時間點處死大鼠7 只，腹主動脈取血，摘取大鼠雙腎，剝離腎被膜，取1/4 腎組織于10%中性甲醛固定，其余腎組織液氮速凍后轉入－80℃冰箱凍存。

1.2.3 生化指標檢測 造模后48 h，應用日本奧林巴斯AU2700 全自動生化分析儀檢測尿素氮(BUN)、Scr。

1.2.4 病理檢查 腎組織石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察造模后24 h、48 h、72 h 的腎病理變化。

1.2.5 ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 在聚乙烯板反應孔中加入準備好的樣品及標準品，37℃反應30 min，洗板;加入酶標試劑反應30 min，洗板;加入顯色液，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min 內讀取OD 值，繪制標準曲線，并計算樣品濃度。

1.2.6 TUNEL 檢測造模后48 h 腎細胞凋亡 中性甲醛固定腎組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，水合，細胞通透，加TUNEL 反應液，再加入標記熒光素抗體的辣根過氧化酶，然后與二氨基苯胺(DAB)反應顯色，光學顯微鏡下觀察并計數凋亡細胞。在細胞凋亡區域，隨機選取5 個視野(×400)，以腎小管上皮細胞凋亡陽性細胞數占腎小管上皮細胞總數的百分比作為腎小管上皮細胞凋亡指數，同時設陰性對照。

1.3 統計學分析

所有資料采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。正態分布數據采用 珋±s 表示，同一時間點不同組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標檢測結果

A 組大鼠造模后各時間段血BUN、Scr 未見顯著變化，B 組和C 組大鼠造模后24 h 血BUN、Scr 顯著升高，48 h 達到高峰，至72 h 有所下降。與A 組相比，B 組大鼠造模后48 h 血Scr 升高2 倍以上，達到CIN 的診斷標準［1］;與B 組相比，C 組大鼠造模后48 h BUN、Scr 水平顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，但仍比A 組嚴重(表1)。

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(珋±s，n=7)

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(珋±s，n=7)

注:Scr，肌酸酐;BUN，尿素氮;A 組，假手術組;B 組，模型組;C組，羥苯磺酸鈣干預組;a，與A 組比較，P ＜0.05;b，與B 組比較，P ＜0.05

項目 A 組 B 組 C組Scr(μmol/L) 34.3 ±5.7 105.6 ±10.8a 66.6 ±3.1 ab BUN(mmol/L) 4.6 ±0.8 54.4 ± 2.8a 48.4 ±3.9 ab

2.2 病理變化

A 組大鼠各時間段均未見明顯病理變化;B 組和C 組大鼠造模后24 h 即出現腎病理損傷，造模后48 h 及72 h 病理損傷嚴重，出現腎小管重度玻璃樣變性、腎小球萎縮;C 組同時間段病理變化較B 組輕，但仍比A 組嚴重(圖1)。

2.3 用ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px

與A 組相比，B 組MDA 表達顯著升高，SOD 及GSH-Px 表達顯著降低，差異均有統計學意義(P ＜0.05);C 組MDA 表達較B 組低，SOD 及GSH-Px 表達較B 組高，但仍未達到A 組水平，差異有統計學意義(P ＜0.05，表2)。

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達情況(珋±s，n=7)

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達情況(珋±s，n=7)

注:MDA，丙二醛;SOD，超氧化物歧化酶;GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶;A 組，假手術組;B 組，模型組;C 組，羥苯磺酸鈣干預組;a，與A 組比較，P ＜0.05;與B 組比較，P ＜0.05

項目 A 組 B 組 C組MDA(nmol/ml) 3.1 ±0.4 6.5 ± 0.9a 4.4 ± 0.9 ab SOD(U/ml) 91.7 ±8.1 66.2 ± 8.0a 78.9 ±11.0ab GSH-Px(U/ml) 90.8 ±7.2 55.7 ±10.4a 62.0 ±10.9 ab

圖1 HE 染色觀察各組大鼠造模后不同時間段的病理改變(×400)

2.4 TUNEL 法檢測造模后48 h 腎細胞凋亡

光學顯微鏡下觀察并計數凋亡細胞，計算腎小管上皮細胞凋亡指數(珋±s，n =7)，3 組的凋亡指數(%)分別為:A 組(0.6 ± 0.5)%，B 組(38.7 ±4.6)%，C 組(8.3 ±3.6)%。A 組腎細胞未見明顯凋亡;與A 組相比，B 組大鼠腎細胞凋亡顯著，凋亡指數顯著升高，差異有統計學意義(P ＜0.05);與B組相比，C 組大鼠腎細胞凋亡明顯減輕，凋亡指數顯著降低，但仍重于A 組，差異有統計學意義(P ＜0.05，圖2)。

3 討論

CIN 是指在使用對比劑48 h 或72 h 內出現的腎損傷，通常指血Scr 絕對值升高≥44.2 μmol/L，或相對基礎水平升高≥25%，且排除其他能夠引起腎損傷的因素，血Scr 水平在3 ～5 d 達到高峰，通常在7 ～10 d 可降至基線水平［1］。目前，CIN 的發病機制尚不明確，較多研究表明，氧化應激和細胞凋亡可能參與CIN 的發病機制［3-5］。

圖2 TUNEL 檢測各組大鼠造模后48 h 腎細胞凋亡情況(如箭頭所示)×400

在正常情況下，氧化應激處于動態平衡狀態，當遭遇外界刺激后，氧化作用超過還原作用，導致細胞損傷。目前認為，CIN 時氧自由基生成增多，存在氧化應激反應。氧自由基的產生途徑包括黃嘌呤氧化酶途徑和細胞色素氧化酶途徑，對比劑可通過改變腎血流動力學使腎內滲透壓增高，同時引起腎實質缺血缺氧，激活黃嘌呤氧化酶引起腺苷分解，導致活性氧的產生;另外，對比劑可通過降低腎皮質中過氧化氫酶和SOD 的活性而導致活性氧的生成增加［8］。有研究發現，應用對比劑后，活性氧產生增加，可導致和增強脂質過氧化和細胞毒性損傷，表明氧化損傷是CIN 的主要發病機制之一［9］。注射對比劑后，起的大鼠腎毒性起預防保護作用［17］。這些研究均 表明羥苯磺酸鈣可作為一種自由基清除劑，具有強產生的氧自由基還可與一氧化氮生成過氧亞硝酸鹽，后者更具氧化性，并且可降低一氧化氮的生物利用度，產生更嚴重的組織損傷［4］。MDA 是脂質氧化應激的產物，是反映氧化應激狀態的經典標志物，且能夠間接反映氧自由基的生成量;清除體內氧自由基的主要系統是抗氧化酶系統，SOD 及GSH-Px 是該系統重要的兩個因子，SOD 能夠將超氧陰離子歧化為過氧化氫，GSH-Px 可以清除過氧化氫及脂質過氧化產物［5，10］。本實驗通過檢測CIN 大鼠模型中以上3 個因子的表達情況，觀察到B 組與A 組大鼠相比，MDA 顯著升高，SOD 和GSH-Px 顯著降低，進一步證實了氧化應激與CIN 的發生密切相關。

細胞凋亡，又稱細胞程序性死亡，是指細胞為維持內環境穩定，由基因控制的、有一系列酶參與的一個主動的、高度有序的死亡過程，是為更好地適應生存環境而主動死亡的過程。有研究發現，對比劑對腎小管具有直接毒性，腎小管上皮細胞的過度凋亡與CIN 發病機制有關［3］。本實驗發現，與A 組相比，B 組大鼠腎細胞凋亡明顯，細胞凋亡指數顯著升高，說明細胞凋亡可能參與CIN 的發病機制。

羥苯磺酸鈣是一種可以改善微循環的藥物，依靠其對內皮素-1(ET-1)、緩激肽等血管活性物質的影響及顯著的抗氧化作用，廣泛應用于糖尿病視網膜病變和慢性靜脈功能不全的治療［11-13］，也有其在氧化應激水平改善冠狀動脈旁路移植術患者缺血/再灌注損傷的研究［14］。近年來，國內外較多研究發現，羥苯磺酸鈣對腎疾病也具有肯定的保護作用。多項研究表明，羥苯磺酸鈣可通過保護血管內皮、抑制腎纖維化、減少纖溶酶原激活抑制因子-1(PAI-1)等機制改善糖尿病腎病［15-16］。另有文獻報道顯示，羥苯磺酸鈣還可以通過減少氧化應激對慶大霉素引大的抗氧化作用。

本實驗通過研究羥苯磺酸鈣對CIN 大鼠生化、腎病理、氧化應激、細胞凋亡等相關指標的影響，探討羥苯磺酸鈣對CIN 的干預效果。通過HE 染色及TUNEL 染色觀察到腎損傷以腎小管最為顯著，說明對比劑主要損傷部位為腎小管上皮細胞。造模大鼠血清中MDA 表達增加，SOD 及GSH-Px 表達顯著下降，說明氧化應激可能參與CIN 的發生發展，與以往實驗結果一致［3-4］。B 組細胞凋亡顯著，表明細胞凋亡亦可能參與CIN 的發生發展。此外，C 組腎病理改變及細胞凋亡較B 組顯著減輕，且MDA 含量較B 組顯著降低，SOD 及GSH-Px 含量較B 組顯著升高，SOD 升高較GSH-Px 明顯，但尚未達到正常狀態。以上實驗結果表明，羥苯磺酸鈣能夠保護CIN大鼠的腎功能，可能機制為羥苯磺酸鈣通過增強SOD 及GSH-Px 的表達增強抗氧化系統，反應性減少MDA 表達，減少氧自由基生成，加快自由基清除，從而對抗氧化應激損傷;另外，羥苯磺酸鈣可能通過減少細胞凋亡發揮對CIN 模型大鼠的保護作用。

綜上所述，氧化應激和細胞凋亡可能參與CIN的發生發展，且該過程主要發生在腎小管上皮細胞。羥苯磺酸鈣可能是通過減輕CIN 大鼠氧化應激和細胞凋亡發揮腎保護作用。關于氧化應激和細胞凋亡介導CIN 發生發展的具體機制及羥苯磺酸鈣發揮腎保護作用的具體途徑有待進一步研究。

［1］Mohammed NM，Mahfouz A，Achkar K，et al. Contrast-induced Nephropathy. Heart Views，2013，14:106-116.

［2］Golshahi J， Nasri H， Gharipour M. Contrast-induced nephropathy;A literature review. J Nephropathol，2014，3:51-56.

［3］Buyuklu M，Kandemir FM，Ozkaraca M，et al. Protective effect of curcumin against contrast induced nephropathy in rat kidney:what is happening to oxidative stress，inflammation，autophagy and apoptosis?Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18:461-470.

［4］Ari E，Kedrah AE，Alahdab Y， et al. Antioxidant and renoprotective effects of paricalcitol on experimental contrastinduced nephropathy model. Br J Radiol，2012，85:1038-1043.

［5］Kongkham S，Sriwong S，Tasanarong A. Protective effect of alpha tocopherol on contrast-induced nephropathy in rats. Nefrologia，2013，33:116-123.

［6］Wu CT，Weng TI，Chen LP，et al. Involvement of caspase-12-dependent apoptotic pathway in ionic radiocontrast urografininduced renal tubular cell injury. Toxicol Appl Pharmacol，2013，266:167-175.

［7］謝泉琨，劉曉城. 羥苯磺酸鈣對2 型糖尿病模型大鼠腎臟氧化應激的影響. 中國藥房，2004，15:721-723.

［8］唐露，魏日胞，耿文佳，等. 對比劑腎病發病機制及干預措施的研究進展.中華臨床醫師雜志(電子版)，2013，7:3062-3064.

［9］Heyman SN，Rosen S，Khamaisi M，et al. Reactive oxygen species and the pathogenesis of radiocontrast-induced nephropathy.Investig Radiol，2010，45:188-195.

［10］Zhu SY，Dong Y，Tu J，et al. Silybum marianum oil attenuates oxidative stress and ameliorates mitochondrial dysfunction in mice treated with D-galactose. Pharmacogn Mag，2014，10(Suppl 1):S92-S99.

［11］Garay RP，Hannaert P，Chiavaroli C. Calcium dobesilate in the treatment of diabetic retinopathy.Treat Endocrinol，2005，4:221-232.

［12］Javadzadeh A，Ghorbanihaghjo A，Adl FH，et al. Calcium dobesilate reduces endothelin-1 and high-sensitivity C-reactive protein serum levels in patients with diabetic retinopathy. Mol Vis，2013，19:62-68.

［13］Alda O，Valero MS，Pereboom D，et al. In vitro effect of calcium dobesilate on oxidative/inflammatory stress in human varicose veins. Phlebology，2011，26:332-337.

［14］Cerrahoglu M，Taner Kurdal A，Iskesen I，et al. Calcium dobesilate reduces oxidative stress in cardiac surgery. J Cardiovasc Surg (Torino)，2009，50:695-701.

［15］高美娟，劉明，李波，等. 羥苯磺酸鈣對早期糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用. 藥學學報，2009，44:126-133.

［16］Zhang X. Therapeutic effects of calcium dobesilate on diabetic nephropathy mediated through reduction of expression of PAI-1.Exp Ther Med，2013，5:295-299.

［17］Jafarey M，Changizi Ashtiyani S，Najafi H. Calcium dobesilate for prevention of gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Iran J Kidney Dis，2014，8:46-52.