ACE、ACE2基因在急性主動脈夾層和冠心病患者中表達(dá)的差異性研究

梁敏，李陽，張爾永

(四川大學(xué)華西醫(yī)院心臟大血管外科，四川 成都 610041)

主動脈夾層雖總體發(fā)病率不高，但近年來有增加的趨勢，當(dāng)主動脈夾層發(fā)生時，其死亡率較高，是嚴(yán)重危及患者生命的臨床急重癥。引起主動脈夾層發(fā)生的高危因素有高血壓、動脈粥樣硬化、血脂異常、吸煙、遺傳因素、外傷等，主動脈瘤也是發(fā)生主動脈夾層的一個病因。但高血壓、動脈粥樣硬化以及動脈瘤在臨床上并不少見，大多數(shù)并未轉(zhuǎn)化為主動脈夾層，而主動脈夾層與遺傳有一定關(guān)系，因此我們設(shè)想這些疾病中可能某些基因的表達(dá)有差異而導(dǎo)致主動脈夾層在某些患者中易發(fā)生。

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是機(jī)體重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在高血壓、動脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展及水鈉潴留中有著重要的調(diào)節(jié)作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme2，ACE2)共同作用于RAS系統(tǒng)，互相拮抗，目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)ACE和ACE2兩者與心血管疾病如高血壓、冠心病、心功能衰竭、心室肥厚、糖尿病、代謝綜合征等疾病有關(guān)。

由此我們通過完成本實(shí)驗(yàn)以了解ACE、ACE2及其基因是否在主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

實(shí)驗(yàn)分為主動脈夾層組、冠心病組以及對照組，對照組為無心血管疾病的正常成年人。共收集2011年3月至2012年10月68例血液樣本，其中急性主動脈夾層34例，冠心病21例，對照組13例;有ACEI及ARB制劑服用史及馬凡綜合征患者未納入本實(shí)驗(yàn)。患者具體臨床資料，見表1。

表1 患者臨床資料

所有患者均于入院后第2天清晨空腹采靜脈血2 mL送檢血漿ACE濃度。

上述患者實(shí)施手術(shù)時于術(shù)中取動脈壁組織，放入液氮罐中后轉(zhuǎn)運(yùn)至－70℃冰箱內(nèi)保存，后續(xù)用于mRNA檢測;實(shí)施開胸手術(shù)并取得主動脈壁組織者主動脈夾層12例，冠心病16例。未取得主動脈壁組織原因?yàn)?主動脈夾層組9例行介入治療，8例非手術(shù)治療，5例術(shù)前死亡;冠心病組2例非手術(shù)治療，3例術(shù)中所取主動脈壁組織太少而棄用。

1.2 組織中ACE及ACE2mRNA表達(dá)的檢測

用Trizol法提取組織總RNA，將提取的總RNA樣本利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用BIO-RAD公司的iScriptTMcDNA Synthesis Kit，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，完成后將cDNA標(biāo)本置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)real time-PCR檢測，反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性180 s→然后95℃10 s，59℃10 s，72℃10 s循環(huán)40次→最后從65℃按0.5℃/s增量至95℃結(jié)束反應(yīng)。ACE、ACE2及β-actin的基因引物及長度資料，見表2。

表2 ACE、ACE2及β-actin的基因引物序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物資料

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計。各組中性別、高血壓史及糖尿病史構(gòu)成比差異采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)每組頻數(shù)＜5時采用精確概率法檢驗(yàn);各組間血清ACE濃度、ACE mRNA表達(dá)和ACE2 mRNA表達(dá)差異比較采用單因素方差分析;P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間患者血清ACE濃度比較

主動脈夾層組 ACE濃度為(17.9±7.9)U/L，冠心病組 ACE 濃度為(33.5±8.1)U/L，對照組ACE濃度為(38.4±4.8)U/L。主動脈夾層組與冠心病組間比較P＜0.001，冠心病和正常人群組間比較P＞0.05，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組間患者組織中ACE表達(dá)結(jié)果

ACE在主動脈夾層組中的表達(dá)為(0.227±0.378);冠心病組中的表達(dá)為(7.086 ±7.693)，P ＜0.05。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組間患者組織中ACE2表達(dá)結(jié)果

ACE2在主動脈夾層組中的表達(dá)為(0.766±0.859);冠心病組中的表達(dá)為(9.613 ±11.543)，P＜0.05。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 各組間患者組織中ACE/ACE2比值比較

ACE/ACE2的比值在主動脈夾層組中的表達(dá)為(0.414±0.449);冠心病組中的表達(dá)為(0.811 ±0.256)。主動脈夾層組明顯低于冠心病組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

ACE是一種含鋅的金屬蛋白酶，主要存在于脈管系統(tǒng)中。ACE將無活性的Ang I轉(zhuǎn)化為強(qiáng)縮血管的 Ang II［1］，后者作用于 AT1，使血管收縮、刺激醛固酮分泌，導(dǎo)致血壓升高;同時，ACE還可以水解緩激肽，使其滅活，而緩激肽可釋放NO、前列腺素等內(nèi)皮細(xì)胞因子舒張血管并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。另外，ACE還可水解其他多種血管活性肽。研究表明AngⅡ可導(dǎo)致超氧陰離子(O2-)、過氧化氮(OONO-)、過氧化氫(H2O2)生成，產(chǎn)生強(qiáng)烈縮血管作用，并誘導(dǎo)多種炎癥因子，激活巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng);同時誘導(dǎo)促進(jìn)血管平滑肌增殖，血管重構(gòu)，導(dǎo)致血管壁損傷和促進(jìn)動脈粥樣硬化。另外，炎癥反應(yīng)可激活活性氧簇，引起組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激在心血管疾病中起重要作用［2－3］，包括可導(dǎo)致動脈粥樣硬化，高血壓，冠心病等;同時，活性氧簇可激活 MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)，MMP-1，MMP-2，MMP-9 在多項試驗(yàn)中已證實(shí)與主動脈夾層/動脈瘤的發(fā)生有關(guān)［4－5］。因此，AngII可能促進(jìn)主動脈夾層的發(fā)生［6］，同時有研究顯示RAS系統(tǒng)在腹主動脈瘤的發(fā)生中起到一定作用［7］。

雖然實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在心衰、高血壓、心絞痛等心血管疾病中 ACE活性在疾病組明顯升高［8－10］，但在本實(shí)驗(yàn)中通過檢測外周靜脈血ACE濃度顯示了與之矛盾的結(jié)果。主動脈夾層組ACE濃度均降低，并且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而冠心病組和對照組ACE濃度無明顯變化。這一變化與升主動脈壁中ACE mRNA的表達(dá)是一致的，主動脈夾層組的ACE mRNA表達(dá)較冠心病組低，且兩兩之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05)。

造成這種現(xiàn)象的原因我們推測可能為:(1)主動脈夾層發(fā)生后機(jī)體變化導(dǎo)致ACE降低。ACE可以通過作用于Ang I使其轉(zhuǎn)化為AngⅡ，而AngⅡ也可調(diào)節(jié)ACE，目前有研究表明，AngII可以通過AT1-ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié))/p38 MAP(有絲分裂原激活蛋白)激酶通路上調(diào) ACE，同時下調(diào) ACE2［11－12］。(2)ACE降低后導(dǎo)致主動脈夾層發(fā)生。ACE使Ang I轉(zhuǎn)化為AngⅡ后產(chǎn)生縮血管作用，當(dāng)ACE過度降低后，對血管的收縮作用下降，可能導(dǎo)致主動脈壁張力發(fā)生改變，而這種張力的改變可能在一定程度上導(dǎo)致了主動脈夾層的發(fā)生，但本實(shí)驗(yàn)例數(shù)偏少，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究來證實(shí)是否存在這種關(guān)系。另外，本實(shí)驗(yàn)主動脈夾層組患者均為急性主動脈夾層，慢性主動脈夾層患者是否也存在類似結(jié)果則不得而知，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

過去認(rèn)為在RAS系統(tǒng)中僅存在ACE-AngⅡ-AT1軸，但在 2000 年 Donoghue［13］和 Tipnis 等［14］分別證實(shí)ACE還存在另一種同源物質(zhì)，也就是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)。由此發(fā)現(xiàn)RAS系統(tǒng)還存在另一分支系統(tǒng):ACE2-Ang(1-7)-Mas軸。ACE2同ACE一樣也為一種含鋅的金屬蛋白酶，研究表明，ACE2的金屬催化區(qū)域與ACE有42%是一致的［13］，編碼ACE2的基因含18個外顯子和編碼ACE的基因含17個外顯子相仿［14］。ACE2在人體內(nèi)的分布不如ACE廣泛，主要分布于心臟、腎臟、睪丸、肺、動脈、靜脈、腦等組織，其中回腸分布最多，在心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腎臟組織分布也較多［15］。ACE2可以使AngII分解成Ang(l-7)，另外，ACE2還可以直接作用于AngI，使其分解成Ang(l-9)，Ang(l-9)再在ACE的作用下分解成 Ang(l-7)，同時 ACE2分解AngII的效率是 AngI的400倍［16］。而 Ang(1-7)生理功能主要為舒張血管、降低血壓、改善冠脈灌注和內(nèi)皮功能，抑制心肌細(xì)胞的肥大、抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖、對血管平滑肌細(xì)胞也同樣有抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)ACE2能分解包括運(yùn)動升壓素、去精氨酸緩激肽等在內(nèi)的其他血管活性肽末端氨基酸殘基［17］。ACE2還能催化分解 aPelin-13和apelin-16的活性，aPelin一13可引起離體冠狀動脈的收縮［18］。ACE2還能刺激機(jī)體產(chǎn)生NO、前列腺素、緩激肽等舒血管物質(zhì)。因?yàn)锳CE2的生理作用表現(xiàn)與ACE相反，國內(nèi)外多項研究已提示ACE2可穩(wěn)定粥樣斑塊、減少血小板粘附、抗血栓形成、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)心肌重構(gòu)，降低血壓等［19－24］，故目前文獻(xiàn)普遍觀點(diǎn)認(rèn)為ACE2在心血管疾病中起到保護(hù)性作用。

本實(shí)驗(yàn)中，ACE2 mRNA在升主動脈壁中的表達(dá)顯示主動脈夾層組明顯低于冠心病組，分別為(0.766 ±0.859)(9.613 ±11.543)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。該結(jié)果提示ACE2在主動脈夾層的發(fā)生中可能起到一定作用，當(dāng)ACE2表達(dá)減少時，對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用減弱，使患者易在動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上發(fā)生主動脈夾層。

結(jié)合ACE mRNA在升主動脈壁中表達(dá)結(jié)果觀察，主動脈夾層組的ACE表達(dá)較低，證實(shí)ACE2在主動脈夾層發(fā)生中可能具有保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)無正常人升主動脈壁ACE和ACE2的表達(dá)結(jié)果，對其在正常人中的表達(dá)情況尚無法知曉。

此外有研究顯示ACE與ACE2比例失衡與心血管疾病發(fā)生有一定關(guān)系［8］，我們在本實(shí)驗(yàn)中也觀察了ACE與ACE2比值在各組間的差異，結(jié)果顯示ACE/ACE2比值在主動脈夾層組和冠心病組中分別為(0.414 ±0.449)，(0.811 ±0.256)。統(tǒng)計分析顯示主動脈夾層組與冠心病組比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示ACE與ACE2比例失衡與不同疾病的發(fā)生可能有一定關(guān)系。

總之，該實(shí)驗(yàn)顯示血漿ACE濃度，ACE和ACE2基因表達(dá)在主動脈夾層中顯著降低，為RASS系統(tǒng)在主動脈夾層發(fā)生中的作用提供了證據(jù)。但是，ACE和ACE2表達(dá)在主動脈夾層的發(fā)病過程中是如何變化的尚不得而知，需要后續(xù)進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

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