尼莫地平對大鼠急性腦缺血再灌注損傷NF-κB和caspase-3蛋白表達的影響

王向慧,王迪

(遼寧醫學院 基礎醫學院，遼寧 錦州 121000)

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尼莫地平對大鼠急性腦缺血再灌注損傷NF-κB和caspase-3蛋白表達的影響

王向慧,王迪Δ

(遼寧醫學院 基礎醫學院，遼寧 錦州 121000)

目的 探討尼莫地平對大鼠急性腦缺血再灌注損傷中NF-κB和caspase-3蛋白表達的影響。方法 45只雄性SD大鼠隨機分為3組，即假手術組、模型組和尼莫地平注射液治療組，每組15只。參照Zealonga等的改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型。腦缺血再灌注后，利用Bederson法評價各組大鼠神經功能評分，采用TUNEL法檢測大鼠海馬CAI區神經元凋亡率，免疫組織化學和Western blot法檢測NF-κB和caspase-3蛋白表達情況。結果 腦缺血再灌注24h后，模型組NF-κB和caspase-3表達均高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比較，尼莫地平治療組NF-κB和caspase-3的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 尼莫地平可能通過抑制NF-κB和caspase-3的蛋白表達，對缺血再灌注損傷起到保護作用。

尼莫地平；腦缺血再灌注；NF-κB；caspase-3

當前對腦組織缺血再灌注引起神經細胞死亡的病理生理機制的研究日趨深入，其臨床應用的最終目的就在于搶救可逆性損傷的腦組織，防止基本數量的腦細胞功能缺失或消失。要達到這一目的，單純的血管再通或神經保護治療均難以勝任。因為單純的血管再通雖有可能恢復缺血區的能量供應，卻不能完全阻斷例如細胞內鈣超載、自由基生成等復雜的病理生理過程，它們仍將促使可逆性缺血損害發展為不可逆性損害，而且還可因為再灌注加劇各種神經細胞死亡。而單純的神經保護治療，雖有一定的療效，但由于梗塞區的血流未恢復，其病理損害亦將繼續。在有效的時間窗內有步驟地將血管再通治療及神經保護治療有機結合、聯合應用，將是以后局灶性腦缺血再灌注損傷治療的理想方法和發展趨勢。目前公認尼莫地平作為一種選擇性鈣通道拮抗劑，具有擴張腦血管的作用，主要用于缺血性腦血管疾病，這無疑是血管再通的理想藥物，就目前一些研究表明，鈣離子紊亂是導致一系列病理生理現象的關鍵因子。因此，本文主要針對鈣通道拮抗劑尼莫地平是否對caspase-3和NF-κB的表達抑制作用進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD大鼠45只，體質量220～250 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。實驗動物合格證號：SCXK(遼)2013-002。

1.2 主要實驗藥品及試劑 尼莫地平注射液購自拜耳先靈醫藥保健股份公司；TUNEL原位檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海潤成科技有限公司；Rabbit anti-NF-κB p65購自武漢博士德公司；Rabbit anti-caspase-3單克隆抗體購自SANTA CRUZ公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自上海合星生物科技有限公司，其余試劑均由遼寧醫學院科學實驗中心提供。

1.3 實驗動物分組與給藥 隨機分為3組，每組15只，分別為假手術組(sham組)、模型組(model組)以及尼莫地平治療組。治療組于再灌注前20 min，再灌注后6、12 h給予腹腔注射尼莫地平(1 mg/kg)，假手術組和模型組則給予相同劑量的等滲生理鹽水。24 h后對各項指標進行檢測。所有大鼠單籠飼養，自由飲水攝食。

1.4 模型的制備 采用Zealonga改良線栓法制備大鼠右側MCAO模型。動物用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結扎CCA、ECA，然后在距CCA分叉部4 mm剪一小口，將栓線插入到ICA，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢栓線。用眼科鑷輕推栓線，從血管分叉處開始算距離，在插入深度在18 mm時，緊緊系牢CCA遠心端的細線。阻斷血流2 h后，抽出栓線，實現再灌注。假手術組除不插栓線外其余步驟同上。再灌注時間為24 h。

1.5 檢測指標

1.5.1 神經學功能評分：各組大鼠均在術后24 h大鼠清醒后，參照Zealonga評分標準對各組大鼠進行神經功能體征評分，1～3分的大鼠為造模成功，對于不符合條件的大鼠預以剔除。0分：正常，無神經功能損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪，輕度神經功能缺損；2分：行走時，大鼠向左側(癱瘓側)轉圈，中度神經功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒，重度神經功能缺損；4分：不能自發行走，意識喪失。對于實驗中剔除及死亡的大鼠均按照嚴格的實驗條件統一進行補充、分組。評分越高，說明神經損傷障礙越嚴重。

1.5.2 TUNEL法對腦組織凋亡細胞進行檢測：腦缺血2 h再灌注24 h后，10%水合氯醛(3 mg/kg)進行腹腔麻醉，開胸，心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，開放靜脈血。夾閉腹主動脈，只灌注上肢及頭腦。先灌注生理鹽水約100 mL，見到大鼠兩前肢及兩肺變白，可改灌注4%多聚甲醛固定，前肢及頸部僵硬表示灌注成功。斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，定向石蠟包埋，5 μM冠狀位切片。將腦組織切片采用TUNEL法檢測海馬CAI區的凋亡陽性細胞，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，細胞核呈棕黃色著色為凋亡陽性細胞。在40×10倍高倍鏡下取互不重疊的5個視野，計數其陽性細胞總數。

1.5.3 免疫組化染色：石蠟切片常規脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育15 min，分別滴加一抗(1:100)在4 ℃下孵育過夜，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1:2000)于37 ℃下孵育30 min，PBS緩沖液洗3次，每次5 min，DAB顯色。顯微鏡下觀察，在40×10倍高倍鏡下取互不重疊的5個視野，計數NF-κB和caspase-3的陽性細胞總數。

1.5.4 Western-blot法檢測NF-κB和caspase-3的蛋白表達：腦缺血再灌注24h后，每組各取大鼠5只，迅速斷頭，取出右側大腦皮層，置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱保存，取出冷凍的腦組織，然后加入RIPA裂解液，用剪刀將其剪碎，并置于超聲波中超聲粉碎20 s后靜置30 min，4 ℃離心20 min，轉速為12000 r/min，留取上清液。按照實驗室常規上樣、電泳、轉膜后，然后用5%脫脂奶粉對其封閉1～2 h，分別加入一抗(1:100)于搖床上平緩搖動，4 ℃下封閉過夜，TBST緩沖液沖洗3次，每次10 min，然后加入二抗(1:2000)于搖床上緩慢搖動，室溫下孵育1～2 h，TBST緩沖液洗脫3次，每次10 min。采用HRP-ECL發光法對其進行檢測。當底片完全定影后，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分 術后，大鼠清醒后，對其進行神經行為學評價，結果顯示與sham組相比，model組和尼莫地平治療組均有明顯的神經功能缺失，差異具有統計學意義(P<0.05)；尼莫地平治療組與模型組比較，神經缺損功能較輕，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能學評分±s)

*P<0.05，與sham組相比，compared with sham group；#P<0.05，與model組相比，compared with model group

2.2 TUNEL檢測大鼠腦細胞凋亡情況 TUNEL法檢測大鼠腦細胞凋亡結果顯示，sham假手術組可見極少數陽性凋亡細胞，model模型組可見大量陽性凋亡細胞，與假手術比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。尼莫地平治療組陽性凋亡細胞較模型組明顯減少，2組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組大鼠海馬區TUNEL染色陽性細胞(×400)Fig.1 Positive cells in the hippocampus CAI region by TUNEL assay(×400)

組別只數凋亡陽性細胞數sham組54.25±2.15model組553.40±12.15*尼莫地平治療組521.20±5.60#

*P<0.05，與sham組相比，compared with sham group；#P<0.05, 與model組相比，compared with model group

2.3 各組大鼠NF-κB和caspase-3表達陽性細胞情況 通過免疫組化實驗可以發現，sham組僅有少量的NF-κB和caspase-3表達，模型組出現大量的NF-κB和caspase-3表達，尼莫地平治療組NF-κB和caspase-3的表達相對模型組有所減少，但與假手術組比較明顯增多，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 免疫組化染色檢測各組大鼠海馬區NF-κB表達陽性細胞和caspase-3表達陽性細胞(×400) Fig.2 NF-κB positive cells and caspase-3 positive cells in the hippocampus CAI region by immunohistochemistry staining(×400)

組別只數NF-κB陽性細胞數caspase-3陽性細胞數sham組53.75±2.156.35±2.35model組519.08±2.45*56.62±13.18*尼莫地平治療組538.40±3.25#31.15±7.65#

*P<0.05，與sham組相比，compared with sham group；#P<0.05, 與model組相比，compared with model group

2.4 Western blot法檢測大鼠腦組織NF-κB和caspase-3蛋白表達情況 實驗結果表明模型組NF-κB和caspase-3蛋白表達均較假手術組顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；尼莫地平治療組NF-κB和caspase-3蛋白表達均較模型組顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 NF-κB和caspase-3蛋白的表達情況Fig.3 Expression of NF-κB and caspase-3 protein detected by Western blot

組別只數NF-κBcaspase-3sham組528.46±3.2226.58±5.00model組5100.00±0.00*100.00±0.00*尼莫地平治療組545.87±4.66#36.77±3.82#

*P<0.05，與sham組相比，compared with sham group；#P<0.05，與model組相比，compared with model group

3 討論

尼莫地平是二氫吡啶類鈣通道拮抗劑，是選擇性作用于顱內血管極強的鈣通道阻滯劑，可特異性與鈣通道有關受體可逆性結合，調節鈣離子流入血管平滑肌內，逆轉血管痙攣，改善腦血流[1]。有研究表明尼莫地平能防止和改善血管痙攣及繼發性缺血，明顯減輕腦水腫的形成及加快水腫的吸收[2]。血腫的吸收速度主要與血腫周圍新生毛細血管的增多及吞噬細胞的聚集有關[3]。張國臣等[4]通過尼莫地平對兔早期脊髓缺血再灌注損傷的保護作用的研究中發現，尼莫地平可以在神經行為學和組織病理學方面有效的降低脊髓缺血再灌注所帶來的一系列序貫性損傷，有一定的保護作用，但其臨床療效仍需在嚴密設計下進行臨床研究予以證實。有相關研究表明鈣通道阻滯劑硝苯地平具有多巴胺神經元中的離子毒性作用和保護神經退行性疾病的作用[5]。細胞凋亡較早發生改變的生化指標之一是細胞內快速而持續的鈣離子濃度升高，以無鈣離子培養基培養或其他方法抑制細胞內鈣離子的升高，均可抑制細胞凋亡的發生，另一特征性生化改變是DNA核小體間降解，這種降解過程發生在凋亡早期，是由內源性核酸內切酶基因的活化和表達所造成，降解片段及長度均為180～200 bp的整數倍數的DNA片段，可用瓊脂糖凝膠電泳檢測，表現為特征性的梯形條帶，染色質DNA斷裂的位置，大部分位于核小體間的連接部位，因此易造成核小體間單鏈切口，也可以用原位切口翻譯技術進行檢測或定量。

細胞凋亡是由死亡信號誘發的受調節的細胞死亡過程，是一種主動性細胞死亡，是腦缺血后神經元死亡的一種重要形式。在腦缺血動物模型中，缺血中心區以壞死為主，而缺血半暗帶則以神經元凋亡為主。蛋白酶系統的級聯反應和各種死亡基因及其產物的調節作用成為近年來凋亡發展研究的中心問題。在受到凋亡刺激時，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(caspase)被激活，誘導細胞凋亡，特異性caspase凋亡抑制劑可阻止凋亡進展，有研究認為caspase對神經元凋亡起關鍵作用，凋亡的最后實施是通過caspase激活而實現的。

Ghost A等[6]在納米膠囊中槲皮素對缺血再灌注損傷的成年鼠和幼鼠的神經損傷的對抗治療中發現，通過納米膠囊槲皮素的口服治療導致iNOS和caspase-3的活性下調，使海馬區神經元計數降低，有助于理解腦缺血神經元損傷的病理生理機制。Christoph M.Zehendner等[7]通過研究發現，急性腦缺血中大腦內皮細胞DNA被切成片段之前，caspase-3被快速激活。caspase-3是許多細胞程序性凋亡不可缺少的部分，在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[8]。線粒體損傷已被證明是細胞色素C釋放進入胞漿中，激活caspase-9，接著引發caspase-3的激活[9]。Daniel Hernandez-Baltazar等[10]通過研究發現在紋狀體注射6-羥基多巴胺，會使細胞骨架喪失完整性，在這個過程中caspase-3和GSK-3β在神經元中的活性被激活，細胞在注射6-羥基多巴胺后發生的病變表明，caspase-3的激活可能是細胞凋亡的內在途徑的激活。NF-κB是神經膠質細胞和神經元中十分重要的轉錄因子，由p50和RelA 2個亞單位組成的異源二聚體，與它的抑制物IκB結合成為一種復合體，平時以靜止形式存在于細胞漿中。當細胞受到缺血等各種刺激時IκB被一種未知的蛋白酶磷酸化后降價，從NF-κB二聚體上脫落。這種與IκB脫離后的NF-κB能夠移位到細胞核內，在它的靶基因的同源序列位點與其結合，使這些基因的表達增加。NF-κB被激活后繼而引起各種基因的表達，它們之中的大多數被認為是參與了腦的炎癥和免疫過程。此外腦組織中病毒的復制也受NF-κB的調控[11]。缺氧刺激可激活NF-κB，從而使p53表達上調，Bcl-2表達下調，此現象可被普羅布考和二氫吡咯二硫卡所抑制[12]。對局灶性腦缺血再灌注模型的研究中，Stepenson發現缺血持續2 h，再灌注2、6、12 h后，缺血后的皮質區及基底節區NF-κB向細胞核遷移，而正常細胞核內沒有發現NF-κB的免疫活性。Schnaider等[13]發現p50基因敲除大鼠與野生型大鼠相比，p50基因敲除大鼠缺血損傷明顯減輕，提示NF-κB損傷缺血腦組織。NF-κB的激活受其細胞質中抑制蛋白IκB的調節。IκB結合NF-κB掩蓋其核定位信號，從而滯留NF-κB于細胞質中。為評價腦缺血后核轉錄因子NF-κB對MMP-9基因表達的潛在機制，采用差速離心結合免疫組化技術，觀察了不同亞細胞組分NF-κB及β-actin蛋白水平變化。提示前腦缺血誘導NF-κB核異位增加功能上調，可能參加了缺血后腦組織基因表達調節[14]。研究表明，NF-κB激活可導致腦缺血再灌注神經元凋亡，其機制并不明確，可能是NF-κB激活后可誘導多種細胞因子、粘附因子和趨附因子高表達，加重腦缺血再灌注損傷。因此抑制NF-κB激活成為治療腦缺血再灌注損傷的新方法[15]。

本研究將為進一步探討尼莫地平保護中樞神經系統的分子機制及將尼莫地平更好地應用于臨床治療提供有意義的實驗依據。結果顯示，尼莫地平能夠顯著抑制caspase-3、NF-κB因子的表達，但其是否直接作用于神經細胞鈣通道，還是間接抑制caspase-3、NF-κB致病因子的表達，需要進一步研究。

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(編校：吳茜)

Effects of nimotop on NF-κB and caspase-3 expression in rat brain tissue after cerebral ischemic reperfusion

WANG Xiang-hui,WANG DiΔ

(Basic Medical College，Liaoning Medical University,Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of nimotop on the expression of NF-κB and caspase-3 in the hippocampus CAI regions of rats with cerebral ischemic reperfusion.Methods45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group, model group and nimotop treatment group,each had 15 rats.The rat model of middle cerebral artery occlussion(MCAO) were established according to Zealonga method.After 24h cerebral ischemia reperfusion, Bederson method was used to evaluate nerve function score, TUNEL method to detect the rat hippocampal CAI area neuronal apoptosis rate, immunohistochemistry and Western blot to detect NF-κB and caspase-3 protein expression.ResultsAfter 24 h cerebral ischemia reperfusion, compared with control group, NF-κB and caspase-3 protein expression in model group were increased, the difference between two group was significant(P<0.05); compared with model group, NF-κB and caspase-3 protein expression in nimotop treatment group were significantly reduced, and the difference was significant(P<0.05). ConclusionNimotop has protective effect to ischemia-reperfusion injury rats, its mechanism may be related to inhibit the NF-κB and caspase-3 protein expression.

nimotop; ischemic reperfusion; NF-κB; caspase-3

錦州市科學技術計劃項目(11A1E32)；國家人力資源社會保障部留學人員科技活動項目(2011LX007)

王向慧，女，碩士，研究方向：腦缺血再灌注損傷及其機制，E-mail：wangxianghui_2009@163.com；王迪，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：腦卒中基礎與應用基礎研究，E-mail：tulip_wang@yahoo.com。

R972.4

A

1005-1678(2015)01-0010-04