黃芪總皂苷對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞增殖及iNOS/NO表達的影響

陳肖,王棟棟,魏彤,何素梅,宋一帆,魏群利,2Δ

(1.徐州醫(yī)學院 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

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黃芪總皂苷對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞增殖及iNOS/NO表達的影響

陳肖1,王棟棟1,魏彤1,何素梅1,宋一帆1,魏群利1,2Δ

(1.徐州醫(yī)學院 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

目的 探討黃芪總皂苷(astragalosides，AST)對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞(MCs)增殖、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達及一氧化氮(NO)含量的影響。方法 將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為正常組、甘露醇組、高糖組及高糖+ AST(50、100、200 μg/mL)組。MTT法觀察細胞增殖情況；Western blot法檢測各組細胞iNOS表達；Griess比色法檢測各組培養(yǎng)上清中NO水平。結果 與正常組比較，高糖組培養(yǎng)24、48 h MCs增殖顯著，胞內iNOS表達增強(P<0.01)、NO含量增加(P<0.01)；與高糖組比較，各濃度AST干預組均能抑制MCs的增殖，并顯著抑制 iNOS表達、減少NO的含量。結論 AST能抑制高糖誘導下MCs的過度增殖；下調iNOS表達、降低NO含量，從而發(fā)揮對糖尿病腎臟的保護作用。

黃芪總皂苷；腎小球系膜細胞；細胞增殖；誘導型一氧化氮合酶；一氧化氮

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]，其基本病理改變?yōu)槟I小球系膜細胞過度增殖，進而導致細胞外基質的異常積聚[2]。DN發(fā)病機制復雜，主要與遺傳因素[3]、血流動力學、糖代謝紊亂[4]、細胞因子和生長因子[5-11]等有關。近年來研究表明，iNOS表達上調進而導致一氧化氮(intrarenal nitric oxide，NO)釋放的增加是早期DN發(fā)病機制的主要因素之一[12-13]。因此，抑制系膜細胞過度增殖[14]、下調iNOS表達從而減少NO的產(chǎn)生可在早期獲得較好的防治糖尿病腎病的效果。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，主要成份是黃芪總皂苷，有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)以及神經(jīng)保護作用[15-17]，并已應用于臨床治療糖尿病腎病[18-20]，但具體作用機制尚未完全闡明。本實驗擬通過研究AST對高糖誘導的MCs過度增殖、iNOS表達及NO生成的影響，進而探討其對DN防治作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HBZT-1大鼠腎小球系膜細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；黃芪總皂苷購自上海源葉生物科技有限公司，批號ZA0424LA13，UV≥98%；DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；4-甲基偶氮唑藍購自美國Sigma公司；兔多克隆抗iNOS抗體購自美國Abcam公司；兔多克隆抗β-actin抗體購自美國Bioworld公司；堿磷酶標記山羊抗兔、總一氧化氮試劑盒購自碧云天生物技術研究所；甘露醇購自江蘇恩華藥業(yè)集團股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制：黃芪總皂苷用DMEM高糖培養(yǎng)基配成20 mg/ mL貯液，-20 ℃保存。臨用前，用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成50、100、200 μg/mL。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：HBZT-1大鼠腎小球系膜細胞接種于含10%新生牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、33.7 mg/L NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.3 實驗分組：MCs以適當密度接種，同步化4 h后，分為6組：正常組(NG組，5.56 mmol/L葡萄糖)、甘露醇組(MA組，5.56 mmol/L葡萄糖 + 24.44 mmol/L甘露醇)、高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖)和高糖+AST(50、100、200 μg/mL)。

1.2.4 MTT測定細胞的增殖：用DMEM培養(yǎng)基制成5×104/mL細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄上清加入無血清正常DMEM培養(yǎng)基，同步化4 h后，在培養(yǎng)相應時間段后(24、48 h)，每孔加入MTT溶液20 μL(濃度為5 mg/mL)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min。利用酶標儀在波長490 nm處測定各孔吸光度(A)，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot 法檢測各組細胞iNOS蛋白表達：MCs按各處理因素處理24、48 h后，冰上裂解提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取80 μg蛋白上樣量，經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳，采用電轉印法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜；膜在5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔多克隆抗iNOS抗體(1:200)，4 ℃封閉過夜；TBST充分洗滌后，加堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗(1:1000)，室溫孵育2 h。滴加BCIP/NBT顯色液，避光顯色15 min。

1.2.6 Griess法檢測培養(yǎng)上清中NO水平：MCs培養(yǎng)24、48 h，收集各處理組細胞培養(yǎng)上清液，操作步驟按試劑盒說明書完成。酶標儀550 nm處測吸光度值，每個樣品3個復孔，取均值。根據(jù)標準孔作出亞硝酸鉀濃度-吸光度值標準曲線，依據(jù)樣品孔吸光度值，在標準曲線上求得各樣孔濃度，記作上清中NO水平。

2 結果

2.1 AST對MCs的增殖抑制作用 MTT結果顯示：高糖組培養(yǎng)24 h、48 h MCs增殖顯著高于NG組(P<0.01)，而各AST干預組均能抑制MCs的增殖，并在24 h、48 h均具有劑量依賴性，見圖1。

圖1 黃芪總皂苷對MCs增殖的抑制作用**P< 0.01，與NG組比較；# P<0.05，##P<0.01，與HG組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與前一個組比較Fig.1 Effects of AST on the MC proliferation**P< 0.01,compared with NG group; # P<0.05,##P<0.01, compared with HG group; △P<0.05，△△P<0.01,compared with former group

2.2 AST對MCs中iNOS蛋白表達的影響 與NG組比較，HG組在 24、48h時，iNOS蛋白水平明顯增高(P<0.01)；與HG組相比，24 h AST的中劑量組與高劑量組iNOS蛋白表達明顯降低(P<0.01)，見圖2；而48 h AST各劑量組iNOS蛋白表達均明顯降低(P<0.01)。

圖2 24 h時各組iNOS的表達量**P< 0.01，與NG組比較；##P<0.01，與HG組比較；△P<0.05，與前一個組比較Fig.2 Relative quantity of iNOS at 24 h**P< 0.01,compared with NG group;##P<0.01, compared with HG group;△P<0.05,compared with former group

2.3 AST對MCs中NO生成的影響 在高糖的刺激下，24 h、48 h MCs釋放NO的量增加，與NG組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明高糖能明顯誘導MCs釋放NO，而各AST組對高糖誘導MCs過度釋放NO均有抑制作用，并在48 h時呈良好的劑量依賴性，見表1。

表1 各組培養(yǎng)液上清中NO含量±s)

**P< 0.01，與NG組比較，compared with NG group；#P<0.05，##P<0.01，與HG組比較，compared with HG group；△P<0.05，△△P<0.01，與前一個組比較，compared with former group

3 討論

DN的病理進程是多種因素綜合作用的結果，其中腎小球系膜細胞增殖、NO生成的增加在DN的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[21]。

腎小球系膜細胞是腎小球的固有細胞，正常情況下，由于抑制腎小球系膜細胞增殖因子的存在，其生長和分裂速率很慢[22]。病理條件下，腎小球系膜細胞增殖活躍、系膜細胞肥大，繼而引發(fā)腎小球纖維化，最終導致腎小球硬化[14,23-24]。在本實驗中MTT結果顯示AST對腎小球系膜細胞的增殖有明顯抑制作用并具有劑量依賴性，與孫晉芳等[25]的研究結果一致。

NO是一個具有廣泛生理活性的小分子，可由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應生成。由于NO對腎臟入球小動脈的擴張作用遠大于出球小動脈，直接參與了糖尿病早期腎小球高灌注和高濾過的形成[26]，進而產(chǎn)生蛋白尿，最終導致腎小球硬化，引起終末期腎衰。NOS可分為兩大類，一類是構成型一氧化氮合酶(constitutive NOS，cNOS)，包括內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases，eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)，是許多正常組織中基本存在的一種酶；另一類是誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)，只在細胞受到刺激如微生物內外毒素、炎癥介質(腫瘤壞死因子、白介素)等的傷害后才表達[27]。研究表明正常生理條件下，人或動物只有出、入球小動脈和腎小球的內皮、上皮細胞中檢測到eNOS，是正常腎臟產(chǎn)生NO的主要來源。iNOS在正常腎小球中少有檢測到，在各種炎癥病理條件下iNOS誘導表達于腎小球系膜細胞[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導下大鼠MCs的iNOS表達增強，NO合成增加，與汪建云等[30]研究一致。AST和高糖共同培養(yǎng)MCs，發(fā)現(xiàn)24、48h時，AST各濃度組均能下調MCs的iNOS表達、降低NO的含量，并在48 h時對NO的抑制具有劑量依賴性。

綜上所述，AST可顯著降低高糖誘導的MCs過度增殖；同時下調iNOS蛋白表達、降低NO含量，這可能是黃芪總皂苷防治糖尿病腎病的機制之一。

[1] Fox CS,Larson MG,Leip EP,et al.Glycemic status and development of kidney disease: the Framingham Heart Study[J].Diabetes Care,2005,28(10):2436-2440.

[2] Dronavalli S,Duka I,Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2008,4(8):444-452.

[3] 李俊燕，譚英姿，馮國鄞，等.糖尿病腎病遺傳學研究進展[J].遺傳，2012，34(12)：1537-1544.

[4] 左祥生，羅敏.DAG-PKC信號傳導通路與糖尿病血管并發(fā)癥[J].國外醫(yī)學(內分泌學分冊)，2000，20(3)：126-128.

[5] 馬麗，周光紀，王燕虹，等.肝細胞生長因子及葡萄糖對人胰腺干細胞向胰島素分泌細胞分化的影響[J].中華糖尿病雜志，2011，3(1)：56-61.

[6] 李思佳，劉育軍.轉化生長因子β對糖尿病腎病作用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13(10)：110-113.

[7] Nakajima H,Takenaka M,Kaimori JY,et al.Gene expression profile of renal proximal tubules regulated by proteinuria[J].Kidney Int, 2002, 61(5):1577-1587.

[8] Noh H, Ha H.Reactive oxygen species and oxidative stress[J].Contrib Nephrol,2011,170: 102-112.

[9] Agarwal A,Nick HS.Renal response to tissue injury:Lessons from heme Oxygenase-1 Gene Ablation and expression[J].J Am Soc Nephrol, 2000,11(5):965-973.

[10] Gao Q,Qin WS,Jia ZH,et al.Rhein improves renal lesion and ameliorates dyslipidemia in db/db mice with diabetic nephropathy[J].Planta Med, 2010,76(1):27-33.

[11] 黃娟，陳文莉，朱紅.大黃酸對輸尿管梗阻大鼠腎組織纖維化的保護機制[J].中國藥師，2009，12(11)：1529-1531.

[12] Komers R,Anderson S.Paradoxes of nitric oxide in the diabetic kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,284(6):F1121-F1137.

[13] Thomson SC,Deng A,Komine N,et al.Early diabetes as a model for testing the regulation of juxtaglomerular NOS I[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2004,287(4):F732-F738.

[14] 魏群利，陸曉和，湯淏，等.中藥復方制劑消可寧對高糖誘導大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(12)：2371-2374.

[15] Rios JL,Waterman PG.A review of the pharacology and toxicology of Astragalus[J].Phytother Res,1997(11):411-418.

[16] Liu G,Song J,Guo Y,et al.Astragalus injection protects cerebral ischemic injury by inhibiting neuronal apoptosis and the expression of JNK3 after cerbral ischemic reperfusion in rats[J].Behav Brain Funct,2013(9):36.

[17] 張文，李維祖，李衛(wèi)平，等.黃芪總苷防治地塞米松誘導小鼠記憶障礙和對APP及β分泌酶mRNA 表達的研究[J].中國中藥雜志，2010，35(5)：624-626.

[18] 魏新平，吳增利，王軍濤.糖尿病腎病應用黃芪注射液聯(lián)合川芎嗪粉針治療的效果研究[J].中醫(yī)臨床研究，2014，6(14)：18-19.

[19] 孫毅宏，趙鳳玲，丁秀云.替米沙坦聯(lián)合黃芪注射液治療早期糖尿病腎病的臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2014，15(9)：799-800.

[20] 趙蕾.大劑量黃芪注射液治療糖尿病慢性腎功能衰竭的臨床觀察[J].中醫(yī)中藥，2014，12(11)：281-282.

[21] Prabhakar SS.Role of nitric oxide in diabetic nephropathy[J].Semin Nephrol,2004,24(4): 333-344.

[22] Baker AJ,Mooney A,Hughes J,et a1.Mesangial cell apoptosis: the mechanism for resolution of glomemlar hypcrcellularity in experimental mesangial proliferation nephritis[J].J Clin Invest,1994,94(5):2105-2116.

[23] Sch?cklmann HO,Lang S,Sterzel RB.Regulation of mesangial cell proliferation[J].Kidney Int,1999,66(4):1199-2207.

[24] Cheng DW,Jiang Y,Shalev A,et a1.An analysis of high glucose and glucosamine-induced gene expression and oxidative stress in renal mesangial cells[J].Arch PhysioI Biochem,2006, 112(4-5):189-218.

[25] 孫晉芳，焦金菊，宋其蔓，等.黃芪皂苷對大鼠腎小球系膜細胞增殖及周期的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(15)：2926-2928.

[26] Ozkor MA,Quyyumi AA.Tetrahydrobiopterin[J].Curr Hypertens Rep,2008,10(1):58-64.

[27] Levine DZ.Hyperfiltration, nitric oxide and diabetic nephropathy[J].Curr Hypertens Rep, 2006,8(2):153-157.

[28] Komers,Anderson S.Paradoxes ofnitric oxide in the diabetic kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,284(6):F1121-F1137.

[29] Choi KC,Lee SC,Kim SW,et a1.Role of nitric oxide in the pathogenesis of diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Korean J Intern Med,1999,l4(1):32-41.

[30] 汪建云，羊倩倩，魏甜甜，等.高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中NO的變化及其對細胞外基質的影響[J].徐州醫(yī)學院學報，2013，33(11)：714-716.

(編校：吳茜)

Effect of astragalosides on proliferation and expression of iNOS/NO in rat mesangial cells cultured with high glucose

CHEN Xiao1,WANG Dong-dong1,WEI Tong1,HE Su-mei1,SONG Yi-fan1,WEI Qun-li1,2Δ

(1.Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China;2.Department of Clinical Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

ObjectiveTo investigate the effect of astragalosides (AST)on proliferation and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS)and nitric oxide (NO)in rat mesangial cells (MCs)cultured with high glucose.MethodsRat mesangial cells were divided into normal group, mannitol group, high glucose group and high glucose + (50, 100, 200 μg/mL)AST group.The proliferation of mesangial cells was observed by MTT assay.The expression of iNOS protein was detected by Western blot and the NO level in the supernatant was determined by Griess method.ResultsCompared with normal group, MCs proliferation and the expression of iNOS and NO increased significantly in high glucose group at 24 h and 48 h (P<0.01).The proliferation of MCs and the expression of iNOS and NO were suppressed in high glucose + AST groups compared with HG group. ConclusionAST can suppress the proliferation of MCs cultured in high glucose and decrease the expression of iNOS and NO, which implies AST may protect the diabetic kidney.

astragalosides; mesangial cells; cellular proliferation; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

陳肖，女，碩士，研究方向： 內分泌藥理學及臨床藥學，E-mail：chenxiao112733@163.com；魏群利，通訊作者，男，博士，教授、碩士生導師、主任醫(yī)師，研究方向：內分泌藥理學及臨床藥學，E-mail：weiqunli@126.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)01-0049-03