八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗(yàn)研究

周影,胡建銘

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，蘇州 215006)

?

八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗(yàn)研究

周影,胡建銘

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，蘇州 215006)

目的 探討臨床宮頸癌原代腫瘤細(xì)胞對8種常用化療藥物組合方案的敏感性。方法 2013年6月～2014年10月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的41例宮頸癌術(shù)中切下腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，再將紫杉醇，紫杉醇+順鉑，紫杉醇+卡鉑，托泊替康+順鉑，吉西他濱+順鉑，多西他賽，吉西他濱以及順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星分別設(shè)定不同藥物濃度梯度[200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%血漿峰值濃度(plasma peak concertration,PPC)]，采用ATP生物熒光法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 8組化療藥物方案血漿峰值濃度下對宮頸癌的敏感性依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。結(jié)論 宮頸癌患者進(jìn)行化療藥物敏感試驗(yàn)具有可行性，對臨床個(gè)體化化療具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)作用。

宮頸癌；原代腫瘤細(xì)胞；化療藥物；敏感性；體外培養(yǎng)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)3大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤之首。近年來發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢。宮頸癌的治療模式為手術(shù)及放療，化療僅僅用于不能手術(shù)的晚期患者的姑息治療或手術(shù)前新輔助化療[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床治療的不斷深入，醫(yī)療工作者發(fā)現(xiàn)手術(shù)和放療不能控制和消除亞臨床病灶和微小轉(zhuǎn)移病灶。隨著化療藥物的更新?lián)Q代、里程碑式的跨越，給藥方法和給藥途徑的不斷改善。選擇針對個(gè)體有效的藥物進(jìn)行化療是治療婦科惡性腫瘤的重要手段之一。本研究通過參考近年來國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[2-3]選擇8種一線及二線宮頸癌化療藥物方案，化療前對個(gè)體宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行藥物體外敏感試驗(yàn)，對其細(xì)胞毒性進(jìn)行比較，挑選出有效的單藥或有效(或敏感)聯(lián)合藥物組成的化療方案，為臨床個(gè)體化化療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月～2014年10月年在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)治療的宮頸癌(經(jīng)病理確診為宮頸原發(fā)惡性腫瘤)患者41例標(biāo)本，年齡24～68歲，平均(43.7±11.2)歲。其中鱗癌32例；腺癌8例；宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例。

1.2 材料 生物熒光抗癌藥物敏感性檢測試劑盒(ATP-chemiluminescence method，簡稱ATP-TCA[11]試劑盒)，由湖州海創(chuàng)生物科技有限公司提供?；熕幬铮鹤仙即?taxol，TAX，百時(shí)美施貴寶公司，H20130281)，順鉑[4](cisplatin，DDP，江蘇豪森藥業(yè)，H20040813)，卡鉑[5](carboplatin，CBP，齊魯制藥，H20020180)，托泊替康[6](topotecan，葛蘭素史克，H20130424)，吉西他濱[7](gemcitabine，GEM，ELI LILLY AND COMPANY，H20110535)，多西他賽[8](docetaxel，江蘇恒瑞醫(yī)藥，H20031243)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，Toronto Research Chemicals Inc.，H20110407)，多柔比星[9](doxoru，ADM，深圳萬樂藥業(yè)，H44024359)。均為一般臨床制劑。其試驗(yàn)濃度依據(jù)藥物的血漿峰值濃度(plasma peak concentration，PPC)確定，以上8種化療藥物的具體血漿峰值濃度見表1。

表1 8種化療藥物的血漿峰值濃度(μg/ mL)

1.3 方法 ATP-TCA操作步驟：取手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，去除其表面的凝血塊及壞死組織等，剪碎、離心，加入組織消化酶溶液，充分消化后離心，去上清，收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至(1～3)×105/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，加入化療藥物，每個(gè)藥物設(shè)5個(gè)濃度(200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC)，同時(shí)設(shè)空白對照孔(不含腫瘤細(xì)胞)及對照孔(含腫瘤細(xì)胞但不加化療藥物)，于5%CO2、37 ℃、95%濕度下孵育5～7 d。加入腫瘤細(xì)胞ATP提取液，混勻后室溫下15 min，取0.05 mL混合液置微板熒光分析儀檢測[11]。按下式計(jì)算各個(gè)化療藥物的抑制率：

抑制率=(1-試驗(yàn)組ATP量/對照組ATP量)×100%。

抑制率≥70%為高度敏感；50%～70%為敏感；30%～50%為低度敏感；<30%為耐藥；當(dāng)抑制率≥50%時(shí)可以推薦臨床使用。

2 結(jié)果

2.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線[10](用于質(zhì)控，用于每次使用系統(tǒng)時(shí)的發(fā)光測試及實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常時(shí)的校驗(yàn))。取各濃度測得的發(fā)光均值，以稀釋濃度的LG對數(shù)值為自變量，以測定結(jié)果均值的LG對數(shù)值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性度，在ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度10-11～10-6mol/mL范圍內(nèi)，2者呈良好的直線相關(guān)關(guān)系(r≥0.975，P<0.001)。

2.2 ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果 在總共收集的41例患者中，41例均具有可評估性?？偪稍u估率約為：100%。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸鱗癌與腺癌的抑制率見表2。

表2 血漿峰值濃度下藥物對鱗癌與腺癌的抑制率均值±s，%)

另外，宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例的癌細(xì)胞藥物的敏感性：TAX單藥為高度敏感，TAX+CBP方案為敏感，DDP+CTX+ADM方案為低度敏感，其余均為耐藥。

宮頸癌不同病理類型藥物敏感性的差異根據(jù)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)P=0.3360，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

資料收集的41例宮頸癌細(xì)胞在不同濃度梯度下8組藥物的腫瘤生長抑制率見表3，8組化療藥物對宮頸癌細(xì)胞體外敏感試驗(yàn)結(jié)果對照見圖1。

表3 不同濃度梯度下8組藥物的腫瘤生長抑制率均值±s，%)

圖1 8組化療藥物對宮頸癌細(xì)胞體外敏感試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Chemosensitivities of cervical carcinoma to eight anticancer drugs

試驗(yàn)結(jié)果顯示：本試驗(yàn)的8組化療藥物隨著濃度增加，對腫瘤細(xì)胞敏感率也逐漸增加。分別在5個(gè)藥物濃度下，對各組藥物作用下腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用之間兩兩比較，進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示均P<0.01，從而得出結(jié)論：8組化療藥物對個(gè)體宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有顯著性差異，血漿峰值濃度下腫瘤生長抑制率依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。

3 討論

經(jīng)典的的宮頸癌化療方案一般選擇：BVP(博來霉素、長春新堿與順鉑)、BP(博來霉素與順鉑)、FP(氟尿嘧啶與順鉑)或者TP(紫杉醇與順鉑)。經(jīng)驗(yàn)性選擇化療方案對宮頸癌細(xì)胞幾乎沒有選擇特異性，因而療效低，同時(shí)易產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[12]；但是臨床上大多憑經(jīng)驗(yàn)用藥，同一化療方案固定不變應(yīng)用于許多患者而忽視了個(gè)體差異，總體療效不佳。本研究采用ATP生物熒光法[6]對41例宮頸癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增大，腫瘤細(xì)胞對各抗癌藥物的敏感性增加，呈劑量依賴性。在患者可耐受的前提下可優(yōu)先選擇TAX+DDP方案，其次為TAX+CBP和單藥TAX方案。有些患者的腫瘤細(xì)胞對某些藥物非常敏感，在濃度為50%PPC時(shí)就表現(xiàn)為高度敏感；而有些細(xì)胞則表現(xiàn)出耐藥，但隨著檢測藥物濃度的增加，當(dāng)在濃度達(dá)200%PPC甚至更高時(shí)，細(xì)胞則表現(xiàn)出敏感。表明增加藥物劑量可以提高療效，這對于能夠耐受大劑量化療的患者有較好的指導(dǎo)意義。參與本試驗(yàn)的41例宮頸癌患者，其腫瘤細(xì)胞對于各組化療藥物的敏感性均不完全相同。Ling ZQ等[13]報(bào)道對食管癌患者進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)為臨床治療提供合理的抗癌方案。O’Toole SA等[14]采用MTS法檢測子宮內(nèi)膜癌以及宮頸癌患者對化療藥物的敏感性，并對比藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效，發(fā)現(xiàn)2者具有較好的相關(guān)性。因此，在臨床選擇化療方案前進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，檢測患者腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合適化療方案，可以顯著提高治療療效，減少不良反應(yīng)及預(yù)防多重耐藥發(fā)生，從而延長患者生存期。

本研究也存在一些不足之處，抗癌藥物的療效是許多作用的綜合結(jié)果，受體內(nèi)諸多因素的調(diào)控和制約，體外細(xì)胞生長環(huán)境無法完全模擬腫瘤體內(nèi)環(huán)境，藥敏試驗(yàn)只是藥物和細(xì)胞的直接作用，僅反映了腫瘤一個(gè)階段，一部分細(xì)胞的情況，無法完全體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性；臨床效果受用藥方法、劑量影響很大，體內(nèi)的藥物濃度及持續(xù)時(shí)間受給藥途徑、肝腎功能等各種因素影響，而試驗(yàn)條件則無法選擇合適的濃度和作用時(shí)間以達(dá)到與臨床完全一致；某些藥物需經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化或免疫系統(tǒng)介導(dǎo)發(fā)揮作用，如環(huán)磷酰胺[15]需經(jīng)過肝臟代謝轉(zhuǎn)化為有效物質(zhì)發(fā)揮作用，而體外藥敏試驗(yàn)無法很好體現(xiàn)這些藥物功效。另外，據(jù)本研究結(jié)果顯示宮頸癌不同組織病理學(xué)間的藥物敏感性差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與宮頸腺癌的樣本量少有關(guān)，有待后期繼續(xù)收集樣本資料，完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

[1] 王平，彭芝蘭，張家文，等.子宮頸癌新輔助化療中不同化療途徑的療效比較[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40(4)：227-230.

[2] 王立峰，劉寶瑞.鉑類、紫杉類藥物個(gè)體化治療研究進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展，2011，9(5)：533.

[3] 沈曉燕，崔恒.復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性子宮頸癌化療的研究進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2013，48(10)：788-791.

[4] Leath CA,Straughn JM.Chemotherapy for advanced and recurrent cervical carcinoma:results from cooperative group trials[J].Gynecologic oncology,2013,129(1):251-257.

[5] 安云婷，李隆玉，鄧克華，等.紫杉醇聯(lián)合順鉑/卡鉑在宮頸癌新輔助化療中的作用[J].實(shí)用癌癥雜志，2007，21(5)：499-501.

[6] Kurtz JE,Freyer G,Joly F,et al.Combined Oral Topotecan plus Carboplatin in Relapsed or Advanced Cervical Cancer:A GINECO Phase I-II Trial[J].Anticancer research,2012,32(3):1045-1049.

[7] 沈連強(qiáng)，張國玲.吉西他濱介入治療晚期和中晚期宮頸癌58例臨床觀察[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003(6)：800-801.

[8] 李學(xué)真，鄒文，李敏，等.多西他賽聯(lián)合卡鉑同步放化療門診治療中晚期宮頸癌的近期療效觀察[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15(30)：3523-3525.

[9] 肖軍霞.多柔比星對人宮頸癌 Hela 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16(22)：1749-1752.

[10] 陳歷排.用微量板 ATP 生物發(fā)光法檢測腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[J].腫瘤，2000，20(2)：103-105.

[11] Sevin BU,Peng ZL,Perras JP,et al,Averette HE.Application of an ATP -bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing[J].Gynecol Oncol,1988,31:191 -204.

[12] Arias JL.Drug targeting strategies in cancer treatment：an overview[J].Mini Rev Med Chem,2011,11(1):1-17.

[13] Ling ZQ,Qi CJ,Lu XX,et al.Heterogeneity of chemosensitivity in esophageal cancer using ATP-tumor chemosensitivity assay[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(3)：401-406.

[14] O’Toole SA,Sheppard BL,McGuinness EP,et al.The MTS assay as an indicator of chemosensitivity/resistance in malignant gynaecological tumors[J].Cancer Detect Prev,2003,27(1)：47-54.

[15] Xiao Y,Li JD,Shi HL,et al.Predictive value of in vitro MTT assay chemosensitivity test of cytotoxic drug activity in cervical cancer[J].chin J cancer,2007,26(4):386-389.

(編校：譚玲，王儼儼)

Study on susceptibility of eight common chemotherapy drug combinations in human cervical carcinoma cell in vitro

ZHOU Ying,HU Jian-ming

(Department of Gynecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China)

ObjectiveTo evalute chemosensivtivity of cervical pro-genetation turercells to eight common chemotherapy dnig combinations.Methods41 fresh specimens of human cervical tumors were selected in the first affiliated hospital of Soochow university from June 2013 to October 2014, then the cells were cultured.The sensitivity of combinations were tested using ATP-bioluminesence method: taxol (TAX), TAX+cisplatin (DDP), TAX+carboplatin (CBP), topotecan+DDP, gemcitabine (GEM)+DDP, docetaxel, GEM and DDP+cyclophosphamide (CTX)+doxoru (ADM) in different concentrations[200%, 100%, 50.0%, 25.0%, 12.5% plasma peak concentration (PPC)].ResultsThe chemosensitivities priority of cervical carcinoma to eight anticancer drugs in plasma peak concentration: TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM> Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM. ConclusionThe ATP-bioluminesence assay in vitro can predict chemotherapy for cervical carcinoma, which has practical guidance for individual chemotherapy.

cervical carcinoma; pro-generation tumor cells; chemotherapy drugs; susceptibility; cultivation in vitro

周影，女，碩士，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:snow.zy131@163.com；胡建銘，通訊作者，女，學(xué)士，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:hu_jm2001@163.com。

R737.3

A

1005-1678(2015)01-0057-03