山茱萸主要有效成分的腦保護作用及其分子機制研究進展

蔡小軍,邵南齊,宋惠珠,李在望,溫浩

(1.南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214023；2.鄭州澍青醫學高等專科學校 基礎醫學部，河南 鄭州 450064)

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山茱萸主要有效成分的腦保護作用及其分子機制研究進展

蔡小軍1,邵南齊2,宋惠珠1,李在望1,溫浩1

(1.南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214023；2.鄭州澍青醫學高等專科學校 基礎醫學部，河南 鄭州 450064)

缺血性腦血管病以其高發病率、高致殘率和高病死率嚴重威脅著人們的健康和生活質量。缺血缺氧可破壞血腦屏障(blood brain barrier，BBB)結構和功能，并進一步觸發腦組織損傷。山茱萸主要有效成分莫諾苷可通過保護神經元細胞、改善氧化應激狀態、抑制炎癥反應等多種途徑緩解腦缺血。本文綜述山茱萸及其主要有效成分腦缺血后發揮神經保護作用的分子機制，以探討其治療靶點及臨床應用價值。

山茱萸；腦缺血；分子機制； 氧化應激；炎癥反應；細胞凋亡

隨著社會發展和人們生活水平提高，缺血性腦血管病已成為導致死亡或殘疾的三大疾病之一。據統計，目前全球每年大約有1500萬人死于腦卒中，其中缺血性腦血管病占80%～85%[1-2]。它不僅引發腦神經細胞壞死，同時易造成遲發性神經元死亡。腦細胞能量代謝障礙、氧化應激、炎癥反應、凋亡基因激活及細胞內鈣離子超載是其主要機制[3]。莫諾苷是從山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉中提取的有效成分，研究證實其可改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，具有明確的神經保護作用[4-5]。本文從分子機制角度就山茱萸及其主要有效成分對腦缺血損傷的保護作用作一綜述，以明確其作用靶點并為其開發成臨床神經保護劑提供借鑒。

1 抑制氧化應激

氧化應激是致腦缺血后腦損傷加重的最主要因素之一。研究證實，腦對缺血缺氧非常敏感[6]。腦缺血后尤其是再灌注期間，氧自由基、羥自由基等多種自由基大量產生，致腦組織內還原性物質煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NAPDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)等被大量消耗，引發脂質過氧化“瀑布狀”連鎖反應，脂質過氧化產物丙二醛(malondialdehyde，MDA)大量生成，導致細胞膜結構和功能破壞，最終引發神經細胞死亡及腦水腫[7]。因此，SOD等活力可反映機體對自由基損傷的抵抗能力，MDA含量變化可間接反映組織中氧自由基含量變化及細胞氧化損傷程度。一氧化氮(NO)作為重要信使及效益分子參與神經毒性及信息傳遞，具有腦保護及神經毒性雙重作用[8]。生理情況下，由內皮細胞來源的一氧化氮合酶(eNOS)誘導產生的NO具有調節血管緊張度、抑制血小板聚集、清除自由基、維持正常血管通透性，同時可激活內皮細胞再生。但缺血再灌注等病理情況下，大量誘導性一氧化氮合酶(iNOS)可在多種炎癥因子誘導下產生進而誘發生成高濃度的NO，與超氧陰離子形成過氧化亞硝酸鹽導致較強的細胞毒性，引發缺血中后期二次腦損傷。此外，大量自由基通過線粒體途徑致細胞色素C釋放增加后激活caspase通路中多個蛋白導致DNA損傷而促進細胞凋亡，同時亦可通過上調核因子NF-κB表達以及受體介導的細胞凋亡途徑，破壞神經血管單元穩態[9]。因此，抑制氧化應激可以改善腦缺血后腦組織損傷。王文等[10]證實，莫諾苷顯著抑制氧化損傷后NO及氧自由基(ROS)產生，提高GSH和超氧化物歧化酶SOD活性，從而減輕SH-SY5Y細胞暴露于H2O2導致的細胞毒作用。提示莫諾苷可通過抑制腦缺血后氧化應激損傷發揮神經保護作用。

2 減輕炎癥反應

炎癥介質直接損傷神經細胞，并可促進β-淀粉樣肽的產生，形成惡性負反饋環路[11]。研究表明，局灶性腦缺血模型炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)和趨化因子-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等表達增加，激活腦內的星形膠質細胞和小膠質細胞產生炎癥反應，加重腦損傷，此過程受NF-KB 調節[12]。NF-κB主要存在于腦血管內皮細胞、神經元和神經膠質細胞中，缺血急性期被特異性激活，進一步誘導內皮細胞粘附分子大量表達并促使中性粒細胞粘附與浸潤；亞急性期，浸潤的白細胞釋放大量細胞因子產生大量自由基并誘導活化基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，促進基底膜降解，并放大腦缺血后腦內的炎癥反應致血腦屏障破壞及腦水腫的發生與發展[13]。此外，全腦缺血再灌注損傷后，腦內TNF-α與 IL-1、IL-8起協同致炎作用誘導強效血管活性物質釋放致血管收縮，局部腦血流量減少，BBB通透性改變，進一步加重腦缺血及腦水腫[14]。因此，腦缺血后抑制NF-κB活化，下調TNF-α、MMPs、IL-1等炎癥因子的表達，可緩解缺血后所引起的腦組織損傷。

以往研究證實，山茱萸環烯醚萜苷可以有效抑制腦梗死動物模型皮層內NF-κB陽性數量的增多，提示其可通過影響腦內NF-κB表達治療腦梗死[15]。Sun FL等[4-5]研究表明莫諾苷可通過下調腦缺血后MMP-2、MMP-9基因及蛋白表達調節腦缺血后BBB的通透性。Caso等[16]研究亦發現在腦缺血急性期有效抑制IL-1β表達可使腦梗死面積明顯縮小。提示山茱萸有效部位環烯醚萜苷及山茱萸有效成分莫諾苷能通過抑制腦組織炎癥反應促進BBB重建，從而發揮神經保護作用。

3 抑制細胞內鈣離子超載

鈣離子(Ca2+)超載是腦缺血再灌注造成神經細胞功能和結構破壞導致神經細胞死亡的“最后共同通路”[17]。鈣穩態的維持與存在是機體各臟器重要生理功能發揮的保障[18]。腦缺血后，神經細胞能量代謝發生障礙、具有攻擊細胞膜引起細胞膜脂類過氧化的自由基大量積聚、N-甲基-D-天(門)冬氨酸(NMDA)受體過度興奮，介導與其偶聯的Ca2+通道開放，增加細胞膜通透性以及Na+-Ca2+交換異常等因素，導致細胞內游離Ca2+濃度異常增高引起嚴重的“鈣超載”[19]，激活Ca2+依賴性蛋白酶降解細胞骨架，同時Na+和Cl-進入細胞，而水被動進入細胞，引起細胞腫脹及ATP 能量合成受阻，從而促發和加劇繼發性腦損傷和腦水腫，導致神經血管單元穩態被破壞[20]。因此，鈣超載既是腦損傷的后果，又是進一步腦損傷的始動因子。

以往通過對過氧化氫(H2O2)誘導人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y體外損傷模型研究發現，莫諾苷可以明顯抑制H2O2引起的Ca2+內流[21]。提示它可能通過直接作用于Ca2+通道阻止其開啟或阻斷高自由基水平與Ca2+通道開放間的信號傳導機制而發揮神經保護作用。

4 抑制細胞凋亡，影響細胞生存狀態

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，它是由諸多啟動因素激發、凋亡基因調控的包括凋亡信號轉導、凋亡基因激活、細胞凋亡執行和凋亡細胞清除在內的一個復雜過程。缺血再灌注損傷與細胞凋亡密切相關，細胞凋亡參與了缺血再灌注損傷的發生與發展過程，且腦缺血再灌注損傷后神經元凋亡的發生與缺血類型、嚴重程度及再灌注時間高度相關[22]，凋亡可能決定了缺血再灌注損傷后最終腦梗死面積[23]。研究表明，參與腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的基因主要包括Bcl-2家族和caspase家族[24]。缺血后在蛋白酶活性改變的同時，線粒體途徑、受體途徑等介導神經細胞凋亡的多條信號通路被啟動，釋放細胞色素C或通過Fas等受體激活caspase通路上的多個蛋白如caspase-3蛋白等，進而導致特異性細胞蛋白被水解，DNA損傷而致細胞凋亡[25]；此外，缺血后海馬、紋狀體Bcl-2表達下調，Bax表達上調，Bcl-2/Bax比值下降，細胞凋亡增加[26]。提示，腦缺血后及時恢復血氧供應、改善微循環的同時，如果能通過調控Bcl-2家族和caspase家族等凋亡相關基因表達，可有效抑制神經細胞凋亡，發揮腦保護作用。

以往研究證實，莫諾苷可明顯下調大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織中凋亡調控因子Bax 及caspase-3基因及蛋白表達、上調Bcl-2基因及蛋白表達，從而改善腦缺血后神經功能損傷[27]。此外，體外研究亦發現莫諾苷除可抑制氧化應激誘導神經細胞損傷后caspase-3表達及上調Bcl-2的表達外，尚可抑制下調細胞內caspase-9的表達，但對其Bax無影響[28]。表明，莫諾苷可通過抑制細胞凋亡，影響細胞生存信號從而發揮神經保護作用。

5 促血管生成和神經生長作用

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是由多種細胞產生的重要信號蛋白，可促進內皮細胞增殖及微血管生成并修復受損神經元，促進腦缺血后大腦血管生成和改善神經元活性[29-30]。腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維細胞生長因子(nerve growth factor，NGF)等是腦內廣泛存在的神經系統重要生物活性分子，由神經元和神經膠質合成，對各種原因造成的腦損傷具有積極的神經保護作用[31]。成熟神經營養因子表達降低或功能缺損可導致腦萎縮及腦缺血等疾病時神經功能障礙[32]。張業貴等[33]采用免疫組化方法檢測到永久性雙側頸總動脈結扎術致大鼠慢性腦缺血后其海馬CA1區BDNF、VEGF陽性神經元數目及表達強度均較正常對照組明顯減少。動物實驗研究證明，單獨或聯合給予外源性VEGF、BDNF等因子，均能很好地減輕缺血缺氧造成的神經損傷，表現為血管生長、神經元凋亡減少、神經再生、大腦梗死病灶體積減小以及動物的神經行為學明顯改善[34-35]。此外，潛麗俊等研究表明NGF可明顯改善新生兒缺氧缺血性腦病預后，減少神經系統后遺癥[36]。提示，上調NGF、BDNF表達可能是改善缺血性腦損傷的另一有效途徑。

孫芳玲等[37]研究報道莫諾苷亦可以促進神經和血管再生，增加神經元和血管數目。黃文婷等[38]Western blot分析結果提示莫諾苷能夠通過Wnt 信號轉導通路增加神經營養因子NGF、BDNF、VEGF 表達，增強神經再生能力，促進BBB重建以及損傷部位恢復和重構，改善神經和運動功能，具有神經血管穩態重構作用。

綜上所述，莫諾苷可通過抑制氧化應激，減輕炎癥反應，降低細胞內Ca2+超載，抑制細胞凋亡，影響細胞生存狀態及促進NGF、BDNF、VEGF等神經營養因子表達治療缺血性腦血管疾病。具體分子機制見圖1。

圖1 山茱萸主要有效成分腦保護作用的分子機制示意圖Fig.1 Neuroprotective effects and underlying molecular mechanisms of cornus officinalis’ primary component

6 結論

腦缺血及其再灌注損傷病機復雜，缺血再灌注損傷已成為臨床治療腦血管病最常見并棘手的難題，目前對其確切治療方法尚處于探索階段。在西醫治療尚未取得預期的良好療效下，傳統中藥及其主要成分無疑為該疾病的治療提供了較為廣闊的前景。近年來，隨著腦缺血分子機制研究的進展，傳統中藥主要成分治療腦缺血已開始取得實際臨床意義。山茱萸及其有效成分莫諾苷用于治療其他疾病如糖尿病及其微血管并發癥的藥物在腦缺血治療實驗研究中取得了滿意效果，它可通過抑制自由基損傷及炎癥反應、降低鈣超載、抑制細胞凋亡等途徑緩解腦缺血再灌注引起的腦損傷。但其深入的分子機制及信號轉導通路尚待進一步研究，如其抑制Ca2+超載是通過阻斷高自由基水平與Ca2+通道開放間的信號傳導還是直接阻止Ca2+通道開啟實現？緊密連接是維持BBB通透性最關鍵的結構，腦缺血后由于再灌注損傷使維持中樞神經系統各項生理活動正常進行的重要基礎和獨特內環境動態平衡的重要結構——BBB結構和功能改變，那么山茱萸及其主要有效成分能否通過調控BBB緊密連接蛋白的表達直接促進BBB重建而發揮神經保護作用呢？ 因此，在目前應用溶栓及神經干細胞治療腦梗塞等缺血性腦血管病逐漸成為研究熱點的同時，探索山茱萸等傳統藥物主要有效成分的分子作用機制及對腦缺血的治療靶點，將為其開發成臨床治療缺血性腦損傷的新藥提供參考。

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(編校：譚玲)

Progress on neuroprotective effects and underlying molecular mechanisms ofCornusofficinalis’s primary component

CAI Xiao-jun1,SHAO Nan-qi2,Song Hui-Zhu1,LI Zai-wang1,WEN Hao1

(1.Department of Pharmacy, Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214023, China; 2.Department of Basic Medicine, Zhengzhou Shuqing Medical College, Zhengzhou 450064, China)

Ischemic cerebrovascular disease with high incidence，mortality and disability，brings a serious threat to human health and quality of life.Ischemia and hypoxia can damage the structural components,function of blood-brain barrier (BBB)and futher injury brain tissue.Morroniside, the primary component ofCornusofficinalis, could alleviate cerebral ischemia though multiple approaches such as protecting neuronal cells, inhibiting oxidative stress and inflammation.This paper reviewed recent progresses in the research on cornus officinalis’ primary component’s neuroprotection and its underlying molecular mechanisms in order to clarify its therapeutic targets and value of clinical application.

cornus officinalis; cerebral ischemia; molecular mechanism；oxidative stress；inflammation；cell apotisis

無錫市科技發展基金項目(SCZ00N1135)

蔡小軍，男，碩士，主管藥師，研究方向：藥理學及臨床藥學，E-mail：cxjleisure999@163.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0181-04