Annexin A5、FOXP3基因與中國漢族女性卵巢早衰的相關性分析

陳蓓麗，周思睿，胡 平，王 晶，鄒薇薇，王彬彬，曹云霞

（1.安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科生殖醫學中心，安徽合肥230022；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京100081）

Annexin A5、FOXP3基因與中國漢族女性卵巢早衰的相關性分析

陳蓓麗1，周思睿2，胡 平1，王 晶2，鄒薇薇1，王彬彬2，曹云霞1

（1.安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科生殖醫學中心，安徽合肥230022；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京100081）

目的 探討中國漢族女性中膜聯蛋白A5（Annexin A5）基因、叉頭樣轉錄因子3（FOXP3）基因多態性與卵巢早衰（POF）之間的關系。方法 在2007年12月至2014年12月來該院就診的中國漢族女性人群中選取POF患者100例（觀察組）和健康女性140例（對照組），挑選能夠覆蓋Annexin A5全基因的4個標簽單核苷酸多態性（Tag SNPs）（rs2306420、rs6857766、rs2306415、rs1383232），FOXP3基因的2個Tag SNPs（rs3761548、rs3761549）作為檢測指標，采用對照研究方法，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）檢測Annexin A5、FOXP3基因型和等位基因在兩組人群中的分布情況。結果 Annexin A5基因的4個Tag SNPs及FOXP3的2個Tag SNPs基因型和等位基因在POF觀察組及對照組的頻率分布差異均無統計學意義（P＞0.05），且Annexin A5基因各位點所能構成的單體型，差異無統計學意義（P＞0.05）。FOXP3基因rs3761548、rs3761549所構成的單體型中AC單體型在觀察組和對照組中的分布情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 該研究排除了Annexin A5基因作為中國漢族女性POF易感基因的可能性，而FOXP3基因AC單體型（rs3761548、rs3761549）人群POF的發生率可能會升高。

膜聯蛋白A5； 基因型； 漢族； 卵巢； 等位基因； 多態性，單核苷酸

卵巢是具有獨特發育周期的內分泌結構，卵泡周期性的更新換代保證和維持了女性的生殖健康和生活質量。原始卵泡池內的卵泡數量生成減少，凋亡閉鎖增加均會引起卵巢功能不全進而發生卵巢早衰（premature premature ovarian failure，POF），即婦女40歲前發生過早絕經的現象。膜聯蛋白A5（Annexin A5）是一種鈣磷脂結合蛋白，膜聯蛋白家族廣泛存在于組織細胞中，參與炎性反應、信號傳導、細胞骨架活動，以及腫瘤細胞增殖、分化與凋亡。近年來，對Annexin A5基因與婦科腫瘤如宮頸癌[1]、子宮內膜癌及婦科內分泌疾病如多囊卵巢綜合征的研究逐漸增多。叉頭樣轉錄因子（FOXP3）是Forkhead轉錄因子家族的重要成員，在維持自身免疫耐受、預防自身免疫疾病方面扮演著重要角色。FOXP3基因的失活突變會引起免疫功能失調、多發內分泌病及腸病等一系列征候群[2]。免疫功能的異常也有可能引起POF的發生。因此，本研究試圖通過檢測基因多態性來探討中國漢族女性中AnnexinA5基因、FOXP3基因與POF之間的關系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2007年12月至2014年12月在本院生殖中心就診的100例POF女性患者作為觀察組，年齡16～40歲，平均（30.40±6.51）歲；月經初潮平均年齡（14.50±1.98）歲，閉經時平均年齡（25.9±6.90）歲。選擇同期在本院就診的月經周期規則、性激素檢查在正常范圍內、無卵巢相關疾病的健康女性140例作為對照組，年齡21～44歲，平均（31.20±4.50）歲。兩組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。所有研究對象對本研究知情同意，并簽訂知情同意書，本研究經醫院倫理道德委員會審查批準。

1.1.2 診斷標準 納入標準：（1）年齡40歲以下的中國漢族女性原發或繼發性閉經3～6個月以上；（2）激素檢測：于月經第3～5天檢測血清促卵泡生成素（folliclestimulating hormone，FSH），至少間隔1個月重復測量大于30 U/L[3]。排除標準：（1）染色體異常；（2）通過詳細的病史詢問、婦科檢查、體格檢查及超聲檢測等排除盆腔創傷史、手術史、放化療史及其他婦科內分泌疾病史等。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 采集符合診斷標準的POF患者及對照人群血樣標本約5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管內，分裝后立即于-80℃冰箱內冷凍保存。

1.2.2 DNA提取 使用血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司），采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統進行DNA抽提。提取后的DNA樣本經NanoDrop2000超微量分光光度計質控，調整所有樣品的DNA濃度至5～10 ng/μL。

1.2.3 標簽單核苷酸多態性（Tag SNPs）的選擇 使用HapMap Database/Haploview軟件，根據Pair-wise方法查找Annexin A5、FOXP3基因的Tag SNPs（以代表整個基因全部SNP），查詢該SNP位點前后各150 bp的序列信息，利用Sequenom網站（http：//www.sequenom.com/iplex）確定各SNP相關性，以及是否各相對分子質量能夠被設計進同一孔中。Annexin A5的4個Tag SNPs為rs2306420、 rs6857766、rs2306415、rs1383232；FOXP3的2個 Tag SNPs為rs3761548、rs3761549。

1.2.4 PCR引物及反應體系設計 利用 Sequenom MassARRAY?相對分子質量陣列平臺的iPLEX GOLD技術，根據待測SNP位點的信息設計PCR引物和反應體系。引物包括1對PCR擴增引物及1條延伸引物。Annexin-a5、FOXP3基因的引物設計結果見表1。

1.2.5 基因多態性檢測 采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）對挑選的6個Tag SNPs進行檢測，最終數據由MassARRAY軟件系統實時收集并統計基因型和等位基因的頻率分布。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件進行相關數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗（理論頻數小于1時使用Fisher精確檢驗法）；利用SHEsis在線軟件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）進行基因內Tag SNPs的單體型分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 Annexin A5、FOXP3基因Tag SNPs的PCR擴增引物序列

2 結 果

2.1 基因型和等位基因的頻率分布 收集數據并進行整理，結果顯示6個Tag SNPs均滿足Hardy-Weinberg平衡。

2.1.1 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布 覆蓋Annexin A5基因的4個Tag SNPs結果如下：rs2306420（C/T）有3種基因型，其頻率分別為：CC（73.7%）、TT（1.0%）、CT（25.3%）；rs6857766（A/G）有3種基因型，其頻率分別為：AA（0.0%）、GG（77.0%）、AG（23.0%）；rs2306415（C/G）有3種基因型，其頻率分別為：CC（66.3%）、GG（3.1%）、CG（30.6%）；rs1383232（A/G）有3種基因型，其頻率分別為：AA（4.2%）、GG（55.2%）、AG（40.6%）。經統計分析，其基因型及等位基因在POF觀察組及對照組的頻率分布比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.1.2 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布 覆蓋FOXP3基因的2個Tag SNPs結果如下：rs3761548（A/C）有3種基因型，其頻率分別為：AA（7.1%）、CC（58.2%）、AC（34.7%）；rs3761549（C/T）有 3種基因型，其頻率分別為：CC（71.9%）、TT（0）、CT（28.1%）。經統計分析，其基因型及等位基因在POF觀察組及對照組的頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.2 AnnexinA5基因形成的單體型關系 經分析，Annexin A5基因的 4個 Tag SNPs中 rs2306420和rs2306415不在同一個block中，由另外2個位點rs1383232和rs6857766所構成的單體型共有3種，但是兩組各單體型分布比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布（%）

表3 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布（%）

表4 Annexin A5基因形成的單體型關系（%）

2.3 FOXP3基因形成的單體型關系 FOXP3基因的rs3761548、rs3761549所構成的單體型共有4種，AC單體型在觀察組和對照組中的分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05），會增加POF的發生風險。見表5。

表5 FOXP3基因形成的單體型關系（%）

3 討 論

POF是婦科疾病中的疑難病癥之一，嚴重影響婦女的生殖健康和生活質量。育齡婦女POF發病率約1%～3%[4]，近年來有逐漸上升趨勢。究其病因，異質性程度高，排除常見的染色體異常、免疫、手術、放療、化療、創傷、感染及代謝等因素外，仍有相當大比例病因不明。有研究表明，遺傳因素是POF的一個重要原因，特發性POF主要是由多基因遺傳及環境因素共同作用引起的復雜疾病[5]。

Annexin A5基因位于人類染色體4q27，全長29kb，共包含13個外顯子。既往研究提示其特殊的分子結構酸性磷脂決定其在參與抗凝、炎性反應及細胞凋亡等過程中發揮重要作用[6]。AnnexinA5能夠在細胞膜上形成側向聚集物，以激發其在胎盤絨毛上的防御功能，從而發揮抗凝作用[7]。復發性流產患者中血栓形成傾向異常，因此，AnnexinA5 M2單體型一直是該病的研究熱點。Demetriou等[8]研究顯示，在自發性流產患者中Annexin A5 M2等位基因的頻率顯著高于對照組。另有研究指出，多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者循環中的AnnexinA5陽性的血小板濃度較對照組升高，可能與PCOS的代謝異常、心血管疾病的發生相關[9]。耿薔等[10]推測，卵丘細胞表達的Annexin A5可能是一種潛在的卵母細胞成熟相關蛋白。卵丘細胞中Annexin A5的表達，隨著卵母細胞的成熟，卵丘細胞中Annexin A5的表達上調。推測Annexin A5蛋白表達水平的變化可能與體內LH峰的作用有關，并可能與LH峰伴隨的卵丘膨脹、卵丘細胞的活躍增殖與代謝、細胞外基質的黏附、卵丘細胞內鈣離子濃度波動等生物過程有關[10]。

POF的本質是卵巢功能提前衰竭，卵子數量生成減少、凋亡增加、成熟障礙都可能引起卵子發育的異常，從而引起女性的生育力下降甚至缺失。推測Annexin A5基因可能通過參與抗凝或炎癥過程的調節從而引起卵巢功能的異常，通過參與調節凋亡和成熟過程而影響卵子的生長發育。因此，本研究試圖探尋Annexin A5基因與POF發病之間是否存在相關性。結果顯示，覆蓋整個Annexin A5基因的Tag SNPs的基因型和等位基因在觀察組和對照組中的頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。兩組研究對象4個Tag SNPs所構成的單體型分布差異也無統計學意義（P＞0.05）。因此，在對Annexin A5基因與POF進行的首次關聯分析中，作者排除了Annexin A5基因作為中國漢族女性POF易感基因的可能性。

1968年，Irwine提出POF的發生可能與自身免疫系統功能異常相關。Silva等[11]研究表明，約20%的POF患者曾經有自身免疫疾病的病史，如甲狀腺功能異常、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血等。FOXP3作為CD4+CD25+調節T（Treg）細胞表面的特征性標志，是Treg細胞發育和功能維持的關鍵因素，在自身免疫疾病的發生中發揮重要作用。本研究在POF人群中篩查FOXP3基因的多態性并進行相關性分析，盡管兩組研究對象覆蓋FOXP3基因的2個Tag SNPs位點的等位基因頻率和基因型頻率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），但由這2個位點所構成的單體型AC在觀察組中的分布明顯高于對照組，因此推測AC單體型相較于其他單體型人群POF的發生風險增大。

綜上所述，本研究選擇標簽SNPs作為檢測指標，利用MALDI-TOF MS對Annexin A5、FOXP3基因的基因型和等位基因，以及Block區內各SNP所能構成的單體型在觀察組和對照組中的頻率分布進行分析，并首次對這2個基因與POF之間的關聯進行研究。排除了Annexin A5基因作為POF易感基因的可能性，提示FOXP3基因可能與POF的發生相關，但該結果仍需進一步擴大樣本量并在不同的人種中進一步驗證。

[1]李欣，高福祿.膜聯蛋白A5在宮頸癌細胞系中的表達[J].承德醫學院學報，2008，25（1）：12-13.

[2]Katoh H，Zheng P，Liu Y.FOXP3：genetic and epigenetic implications for autoimmunity[J].J Autoimmun，2013，41：72-78.

[3]Cox L，Liu JH.Primary ovarian insufficiency：an update[J].Int J Womens Health，2014，20（6）：235-243.

[4]Luborsky JL，Meyer P，Sowers MF，et al.Premature menopause in a multiethnic population study of the menopause transition[J].Hum Reprod，2003，18（1）：199-206.

[5]Persani L，Rossetti R，Cacciatore C.Genes involved in human premature ovarian failure[J].J Mol Endocrinol，2010，45（5）：257-279.

[6]高丕堯，高楓，甘嘉亮.Annexin-a5在相關疾病中作用機制的研究進展[J].基礎醫學與臨床，2015，35（1）：104-107.

[7]Bouter A，Gounou C，Bérat R，et al.Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair[J].Nat Commun，2011，2：270.

[8]Demetriou C，Abu-Amero S，White S，et al.Investigation of the Annexin-A5 M2 haplotype in 500 white European couples who have experienced recurrent spontaneous abortion[J].Reprod Biomed Online，2015，31（5）：681-688.

[9]Willis GR，Connolly K，Ladell K，et al.Young women with polycystic ovary syndrome have raised levels of circulating annexin V-positive platelet microparticles[J].Hum Reprod，2014，29（12）：2756-2763.

[10]耿薔.利用蛋白質組學方法尋找人卵丘細胞中的卵母細胞成熟相關蛋白[D].廣州：南方醫科大學，2011.

[11]Silva CA，Yamakami LY，Aikawa NE，et al.Autoimmune primary ovarian insufficiency[J].Autoimmun Rev，2014，13（4/5）：427-430.

Analysis on correlation between Annexin A5，FOXP3 genes and idiopathic premature ovarian failure in Chinese Han females

Chen Beili，Zhou Sirui，Hu Ping，Wang Jing，Zou Weiwei，Wang Binbin，Cao Yunxia
（1.Reproductive Medicine Center，Department of Gycocolegy and Obstetrics，First Affiliated Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China；2. Scientific and Technical Research Institute of National Health and Family Planning Commission，Beijing 100081，China）

Objective To investigate the correlation between the polymorphisms of Annexin A5 and FOXP3 genes with the premature ovarian failure（POF）in Chinese Han females.Methods Among 100 Han female cases（observation group）of POF in our hospital from December 2007 to December 2014 and 140 healthy females（control group），4 tag SNPs（rs2306420，rs6857766，rs2306415，rs1383232）covering the entire sequence of the gene Annexin A5 and 2 tag SNPs（rs3761548 and rs3761549）of gene FOXP3 were selected as the detection indicators.The case-control research method was adopted.The matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）was used to detect the distribution situation of Annexin A5 and FOXP3 genotypes and allele in the two groups.Results No statistically significant difference was found in the distributions of genotypes and alleles for 4 tag SNPs of gene Annexin A5 and 2 Tag SNPs of FOXP3 gene between the observation group and control group（P＞0.05）.Moreover the haplotype constituted by various loci of Annexin A5 gene had no statistical difference（P＞0.05）. The haplotype constituted by FOXP3 gene rs3761548 and rs3761549 in the observation group was significantly higher than that in the healthy control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion This research excludes the possibility of Annexin A5 gene as the POF susceptible gene in Chines Han females，however，the occurrence rate of POF may be increased in the female group with haplotype AC（rs3761548，rs3761549）of FOXP3 gene.

Annexin A5； Genotype； Han nationality； Ovary； Alleles； Polymorphism，single nucleotide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.001

A

1009-5519（2015）23-3529-03

2015-09-20）

國家“973計劃”項目（2014CB944704）；安徽醫科大學第一附屬醫院青年基金項目（3101005002501）。

陳蓓麗（1985-），女，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事生殖內分泌疾病相關研究工作；E-mail：cbl0118@126.com。

曹云霞（E-mail：caoyunxia6@126.com）。