原因不明復發性流產患者母胎界面TNF-α的表達

楊美霞 宋 芳 趙紫薇包頭醫學院組織學與胚胎學教研室，內蒙古包頭 014040

原因不明復發性流產患者母胎界面TNF-α的表達

楊美霞 宋 芳 趙紫薇
包頭醫學院組織學與胚胎學教研室，內蒙古包頭 014040

[摘要]目的 研究TNF-α在原因不明復發性流產患者蛻膜及絨毛組織中的表達水平及意義。 方法 應用免疫組織化學和圖像分析，分別對30例原因不明復發性流產患者（病例組）和30例正常妊娠者(對照組)蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達進行定位和半定量分析。 結果 免疫組織化學結果顯示在蛻膜組織中，TNF-α蛋白表達于蛻膜細胞質內，絨毛組織中，TNF-α蛋白表達于細胞滋養層和合體滋養層細胞質內。蛋白含量測定結果顯示，病例組TNF-α蛋白表達高于對照組。 結論 病例組蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達的升高與原因不明復發性流產有關，TNF-α可能參與原因不明復發性流產的病理過程。

[關鍵詞]原因不明復發性流產；TNF-α；蛻膜；絨毛

原因不明復發性流產指排除所有已知引起流產原因、連續3次或3次以上的反復流產。臨床上復發性流產的病因較復雜，除了內生殖器官解剖異常、染色體異常、感染性疾病及環境因素外，仍有超過50%的患者病因不明[1]。大量研究表明輔助T細胞Th1/Th2的平衡與妊娠結局有密切的關系[2-4]。TNF-α是一類主要由Th1細胞分泌的細胞因子，目前有關復發性流產患者外周血中TNF-α變化的研究較多，但是關于原因不明復發性流產患者母胎界面TNF-α蛋白表達的報道較少，因此本研究應用免疫組織化學方法對原因不明復發性流產患者母胎界面TNF-α的蛋白表達進行定位和半定量分析，以探討原因不明復發性流產發生的免疫機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取30例2011年3月～2012年4月在包頭醫學院第二附屬醫院婦產科門診就診的不明原因復發性流產患者作為病例組，入選標準：年齡25～41歲，平均（32.0±1.2）歲。孕周6～12周。自然流產次數均≥2次。經檢查排除內分泌、染色體、自身免疫、以及生殖道感染和生殖系統解剖結構等方面疾病后納入本次研究。選取30例同期就診于包頭醫學院附屬醫院婦產科門診，要求人工流產終止妊娠的正常早孕婦女作為研究對照組，入選標準：年齡在24～39歲，平均（30.4±0.2）歲。孕周6～10周。既往月經周期規律，無自然流產、死胎、死產史，本次妊娠孕囊符合停經時間，無陰道流血，胚胎發育正常。對照組和病例組于行人工流產時或自然流產發生24h內收集蛻膜及絨毛組織，生理鹽水沖洗組織后用4%多聚甲醛溶液固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，將蠟塊切為4～8μm厚的組織切片。

1.2 主要試劑

TNF-α多克隆抗體（兔抗人）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋，即用型SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學顯色

蛻膜和絨毛組織切片先行脫蠟和水化；滴加0.3% H2O2室溫孵育10min；將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復3min，使抗原的位點暴露出來；滴加正常山羊血清封閉液室溫20min；滴加一抗（1∶50的兔抗人TNF-α抗體工作液） 4℃過夜，用PBS代替一抗做陰性對照；加二抗后37℃孵育40min；加SABC后37℃孵育40min；于室溫DAB-H2O2顯色，顯微鏡下觀察，以控制反應時間；蘇木素輕度復染細胞核；脫水，透明，封片后鏡下觀察。

1.4 圖像分析

選取對照組（30例）和病例組（30例）中每例蛻膜組織切片2張、絨毛組織切片2張，在蛻膜組織的蛻膜細胞、絨毛組織的合體滋養層細胞、細胞滋養層細胞分別隨機選取2個單位面積，應用捷達801圖像分析系統進行分析測量平均光密度。

1.5 統計學處理

本研究以對照組和病例組平均光密度作為計量資料，采用SPSS17.0軟件的測量數據進行統計學處理，組間進行t檢驗，計算平均值與標準差，計量數據用（±s）的形式表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的組織學定位

在子宮蛻膜組織中， TNF-α蛋白主要定位于蛻膜細胞的細胞質內，呈棕黃色顆粒，兩組陽性反應強弱不等（圖1A、B），兩組的腺上皮細胞內均未見表達。在絨毛組織中，病例組和對照組均可在合體滋養層細胞和細胞滋養層細胞質內見到棕黃色陽性反應顆粒（圖1C、D）。

圖1　蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白免疫組織化學顯色，×400，×200。A，C：對照組；B，D：病例組；A，B：蛻膜細胞；C，D：絨毛滋養層細胞

2.2 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的半定量結果

病例組的蛻膜組織和絨毛組織中TNF-α蛋白含量均高于對照組，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　兩組蛻膜和絨毛組織中的TNF-α蛋白相對含量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01

組別 　n　　蛻膜 　　絨毛對照組　30　0.148±0.021 　 0.129±0.035病例組t 30　 0.123±0.037*2.31 0.102±0.064*3.45

3 討論

隨著免疫學和分子生物學的快速發展，復發性流產病因的免疫學說日益受到重視。Th1/Th2型細胞因子的平衡與妊娠結局有很大關系。正常情況下，妊娠表現為一種特殊的Th2現象，Th1處于一種抑制狀態，當發生向Th1型細胞因子過度表達時，將導致流產發生[5-6]。

TNF-α是一類主要由Th1細胞分泌的細胞因子，適量的TNF-α在妊娠早期可調節細胞滋養層和合體滋養層細胞的正常增殖、分化、凋亡，助于蛻膜細胞外基質降解及胎盤植入，利于能量代謝和胚胎發育，促進孕激素和絨毛促性腺激素的生成，對正常妊娠的維持和分娩的發動發揮重要作用[7-9]。黃江寧、鈄曉珍等[10-11]檢測到復發性流產患者外周血中TNF-α水平較健康早孕婦女明顯升高，國內關于TNF-α蛋白在不明原因復發性流產患者蛻膜和絨毛組織中的定位及半定量表達情況的研究報道還較少，因此本研究采用免疫組織化學方法從蛋白質水平檢測不明原因復發性流產患者蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達情況。

高艷霞等[12]研究顯示TNF-α主要表達于絨毛滋養層細胞內，在蛻膜細胞內無表達，而本研究檢測到絨毛滋養層細胞和蛻膜細胞內均有TNF-α表達。結果顯示在不明原因復發性流產患者的蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達相對含量明顯高于正常早孕婦女，這與Smith等[13]的研究結果一致，提示復發性流產患者母胎界面TNF-α的高表達與流產相關。高濃度的TNF-α 可能與細胞滋養層和合體滋養層細胞中的TNF-α受體結合從而限制細胞滋養層和合體滋養層的生長發育，導致早期胚胎的營養供給和吸收，不利于胚胎著床和妊娠維持。孫燕[14]等研究表明TNF-α能通過激活肥大細胞而損壞母體子宮蛻膜內環境的穩態，致使胚胎停育。Clark等[15]研究表明在母胎界面TNF-α表達增加時對促凝血酶原激酶Fg12的表達有上調作用，使胎盤滋養血管纖維素沉積、血栓形成乃至胎盤梗死[16]，說就證明高表達的TNF-α是通過多種途徑導致流產發生的。

綜上所述，TNF-α蛋白在母胎界面的高表達與原因不明復發性流產的發生有密切關系，為該病發病免疫學說提供了證據。由于引發復發性流產的免疫機制極其復雜，因此TNF-α在復發性自然流產中的作用機制還需進一步多方面深入研究。

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Expression of TNF-α at maternal-fetal interface in women with unexplained recurrent spontaneous abortion

YANG Meixia SONG Fang ZHAO Ziwei
Department of Histology and Embryology, Baotou Medical College, Baotou 014040, China

[Abstract]Objective To study the expression of TNF-α in decidua and villi of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA). Methods With immunohistochemical method and image analysis technology, the local and quantitative expression of TNF-α were detected and analyzed between the patients of URSA (case group) and the patients of normal induced abortion(control group). Results Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytoplasm of decidua cells in decidua, Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytotrophoblast and synctiotrophoblast cells in villi. The expression of TNF-α protein in case group was distinctively higher than control group. Conclusion The increased expression of TNF-α in decidua and villi is related to URSA, TNF-α may take part in the pathologic process of URSA.

[Key words]Unexplained recurrent spontaneous abortion; TNF-α; Decidua; Villi

[中圖分類號]R714.21

[文獻標識碼]B

[文章編號]2095-0616（2015）24-78-03

[基金項目]包頭醫學院秦文斌科技教育基金項目（201105）。

收稿日期：（2015-10-15）