超聲輔助提取紅豆蛋白及其功能特性初步研究

劉立　陳學林　羅巧玲

摘要[目的]優化超聲輔助法提取紅豆蛋白的工藝，同時探討紅豆蛋白功能特性。[方法]采用超聲輔助法提取紅豆蛋白，在單因素試驗基礎上，選擇最佳的料液比、提取pH、超聲時間、溫度為影響因子，以紅豆蛋白提取率為響應值，確定最優的工藝條件并研究紅豆蛋白功能特性。[結果] 超聲輔助法提取紅豆蛋白最優的工藝條件為：料液比1∶11.2 g/ml、pH 7.2、超聲時間52 min、溫度51 ℃，紅豆蛋白提取率可達到81.20%。紅豆蛋白功能特性研究表明：遠離等電點及NaCl濃度為0.8 mol/L時，紅豆蛋白具有良好的持水性、溶解性、乳化性及乳化穩定性；蔗糖會增加紅豆蛋白的持水性，但會降低其溶解性，對乳化性和乳化穩定性影響不大；溫度在60 ℃時紅豆蛋白持水性、乳化性及乳化穩定性較好，在50 ℃溶解性與吸油性較好，且都隨溫度的進一步升高而減小。[結論] 研究可為紅豆蛋白的開發利用和生產研究提供一定的理論基礎和數據參考。

關鍵詞紅豆；超聲法；蛋白功能特性

中圖分類號S521文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）07-302-05

Preliminary Study on the Tltrasonic-aided Extraction of Adzuki Bean Protein and Its Functional Properties

LIU Li， CHEN Xue-lin*， LUO Qiao-ling （College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To optimize technique for extracting adzuki bean protein by ultrasonic assisted method， discuss functional characteristics of adzuki bean. [Method] Based on the single factor experiment， the optimal solid-liquid ratio， pH， ultrasonic time， temperature as influencing factors， extraction yield as response value， the optimal conditions were determined and functional characteristics were studied. [Result] The best combination was：solid to liquid ratio 1∶11.2 g/ml， pH 7.2， extraction time 52 min， extraction temperature 51 ℃， and the yield of adzuki bean protein reached up to 81.20%. The results of studying on functional properties of adzuki bean protein indicated that better ability of water retainmen， solubility， emulsibility and emulsion stability of adzuki bean protein were observed at pH far away from isoelectric point and concentration of NaCl at 0.8 mol/L； and along with sucrose concentration increasing， the ability of water retainmen increased， but the solubility decreased and no pronounced changes in the emulsibility and emulsion stability； ability of water retainmen， emulsibility and emulsion stability of adzuki bean protein were better at 60 ℃， solubility， oil absorption were better at 50 ℃， and all decreased following with the further increase of temperature. [Conclusion] The study can provide a certain theoretical basis and data reference for development， utilization and production of adzuki bean protein.

Key words Adzuki bean； Tltrasonic； protein fuctional properties

紅豆 （Vigna angularis）又叫赤豆、小豆、紅小豆等，是我國重要的豆科豇豆屬植物，營養全面，富含蛋白質、膳食纖維、維生素B族等物質，含有較低的脂肪和鐵、鉀、磷、鈣等多種礦質元素，并含有其他豆類植物含量少或者沒有的三萜皂苷等成分。紅豆入藥有治療水腫腳氣、瀉痢、癰腫、補血等藥理活性[1]，并為緩和的清熱解毒藥及利尿藥。此外，紅豆還能夠補脾、益氣、益腎、補肝和抗氧化，抑制癌細胞的增長，對糖尿病有一定的營養保健功能[2-3]，開發利用前景極為廣闊。目前，國內外對紅豆的研究主要還集中在淀粉理化性質方面的研究[2，4]、天然色素的提取[5-6]、抗氧化的功能[7-8]及其食品開發方面[9-10]，在紅豆蛋白提取方面及其應用研究方面的報道相對比較缺乏[3，11]。

筆者采用超聲輔助法提取紅豆蛋白質，通過星點設計優化紅豆蛋白的提取工藝，并對紅豆蛋白的溶解性、吸油性、持水性、乳化性及乳化穩定性進行研究，旨在為紅豆蛋白的開發利用和生產研究提供一定的理論基礎和數據參考。

1材料與方法

1.1材料

紅豆，購于甘肅省張掖市甘州區新樂超市；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、85%濃磷酸、95%乙醇、氯化鈉、蔗糖，均為國產分析純。PL-203電子天平，722型可見分光光度計，SB120DT超聲波清洗機，LNG-798A離心機，HJ-3數碼恒溫磁力攪拌器，DHG-9101·1型電熱恒溫干燥箱。

1.2方法

1.2.1標準曲線的繪制。

精確稱取牛血清蛋白0.012 mg，加入0.15 g NaCl，用少量蒸餾水溶解定容至100 ml，配制120 g/ml的牛血清蛋白質標準液。準確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml上述溶液用蒸餾水稀釋至1.0 ml，分別加入5.0 ml考馬斯亮藍G-250溶液，在595 nm處測定其吸光值[12]。以試管中標準蛋白的總量（μg）為橫坐標，相應的吸光度的值為縱坐標繪制標準曲線，并制作線性回歸曲線，得到回歸方程為：Y=0.005 9 X+0.024 5，R2=0.993 9，兩者之間有較顯著的相關性。

1.2.2紅豆蛋白提取及含量測定。

按照試驗步驟稱取適量粉碎的紅豆粉，加入相應體積不同pH的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液，在一定的溫度、時間條件下進行超聲浸提，浸提液在3 000 r/min條件下離心5 min，取上清液1.0 ml加入5.0 ml考馬斯亮藍溶液測其吸光值，計算樣品中的蛋白質的質量以及提取率。提取率計算公式為：

提取率（%）=樣品中蛋白質質量紅豆粉質量×100%

1.2.3試驗設計

1.2.3.1單因素試驗。

分別以提取溫度、pH、料液比、提取時間為影響因素，以紅豆中蛋白質含量為考核目標，確定各個因素對紅豆蛋白質提取率的影響。

1.2.3.2BB試驗設計與響應面分析。

在單個因素試驗的基礎上，對影響紅豆蛋白提取率的料液比、pH、提取時間、提取溫度4個因素進行BB試驗設計[13]，各因素設置5水平用代碼-2、-1、0、1、2表示，試驗因素水平見表1。

表1Box-Behnken試驗因素水平

水平因素

料液比（X1）g/mlpH（X2）時間（X3）min溫度（X4）℃

-21∶5.06.03030

-11∶7.56.54040

01∶10.07.05050

11∶12.57.56060

21∶15.08.07070

1.2.4紅豆蛋白性質測定。

1.2.4.1

持水性能測定。

用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節0.01 mol/L的Na2HPO4溶液，將其設置為不同的pH溶液，用1.0 mol/L的NaCl溶液配制成不同濃度梯度的鹽溶液；稀釋50 g/L的蔗糖溶液配制成不同質量濃度的蔗糖溶液。分別取以上各溶液1.5 ml和不同溫度的蒸餾水1.5 ml，加入提取出來的紅豆蛋白粗品5 mg，攪拌均勻后放置20 min，使其充分的吸水，在3 000 r/min條件下離心30 min，傾出上清液，稱量沉淀的質量，按以下公式計算紅豆蛋白的持水性[14]：

赤豆蛋白持水性（g/g）=離心后沉淀質量-蛋白粗品質量蛋白粗品質量

1.2.4.2乳化性和乳化穩定性測定。

配制不同pH、不同NaCl濃度以及不同蔗糖質量濃度的混合溶液，分別取50 mg/ml紅豆蛋白粗提物，加入1 ml的大豆油，將其超聲處理2 min，3 000 r/min離心5 min，按以下公式計算紅豆蛋白的乳化能力[15]。

乳化性（%）=乳化層體積離心管中液體總體積×100

通過以上方法得到的混合液放置于80 ℃條件下保溫30 min，然后將其冷卻至室溫，用30 000 r /min離心5 min，取出后測量乳化層的體積。乳化穩定性計算公式為：

乳化穩定性（%）=乳化層剩余體積乳化層初體積×100

1.2.4.3吸油性測定。取紅豆蛋白粗體物5 mg，加入1.5 ml大豆油將其攪拌均勻，在不同的溫度下靜置30 min，之后再3 000 r/min離心15 min，去除游離油，按照以下公式計算紅豆蛋白的吸油性[16]：

赤豆蛋白吸油性（g/g）=

離心后沉淀質量-蛋白粗品質量蛋白粗品質量

1.2.4.4

等電點測定。分別配制一定濃度不同pH的紅豆蛋白溶液，在3 000 r/min條件下離心30 min，取上清液測定蛋白質含量，蛋白質濃度最低時的pH就是等電點[17]。

2結果與分析

2.1單因素試驗

分別把提取溫度、提取時間、料液比、pH作為影響因素，以紅豆蛋白質含量為考察目標，確定了最佳的料液比為1∶10 g/ml，最適的pH為7，最佳提取時間為50 min，最適的提取溫度為50 ℃。

2.2紅豆蛋白提取工藝的優化

以紅豆蛋白提取率Y作為因變量，使用Design-Expert 8.0.5.0軟件對各因素（自變量）進行二次多項式擬合，得到以紅豆蛋白提取率為目標函數的二次回歸程為：Y=81.20+0.86X1+0.66X2+0.59X3+0.57X4+0.060X1X2+0.046X1X3-0.045X1X4-0.29X2X3-0.39X2X4-0.21X3X4-0.88X21-0.80X22-0.83X23-0.81X24。此預期模型的相關系數為R2=98.06%，模型擬合程度較為良好，說明這個方程可以較好地解釋以上4個單因素對紅豆蛋白提取率的影響程度。

表2CCD試驗設計與結果

F失擬=4.47，P失擬=0.056 1。***差異極顯著（P<0.001）；**差異高度顯著（P<0.01）；*差異顯著（P<0.05）[18] 。

由此能夠看出，模型的顯著性水平小于0.001，此時的回歸方差模型是極顯著，這個方程和實際情況的擬合很好，很好地反映出了紅豆蛋白提取率和溫度、料液比、pH、超聲時間的關系。在選取的各因素的水平范圍以內，根據對紅豆蛋白提取率影響程度排序，得：X1>X2>X3>X4，即料液比>pH>提取時間>提取溫度。

2.3響應面分析

響應面方法（RSM）的圖形是一種特定響應值Y和對應因素X1、X2、X3、X4構成的一個三維空間圖，可以直觀地反映各個因素之間的交互作用對響應值的影響情況，這樣有利于確定最佳提取工藝的參數范圍。固定這2個因素在零水平，研究其他2個因素之間的交互效應，使用Design-Expert 8.0.5.0軟件做響應面圖，結果見圖1。

圖1不同因素對紅豆蛋白提取率的響應面圖及等高線

安徽農業科學2015年

2.4優化試驗驗證

按照CCD優化的試驗結果，確定的最佳提取工藝條件為料液比1∶11.2 g/ml、pH為7.2、超聲時間為52 min、溫度為51 ℃，在優化的提取工藝條件下提取3次求取平均值，和最佳提取工藝條件下模擬結果進行了比較。結果顯示，預測值為82.145 5%，實測值為81.20%，偏差率為0.255%。實測值與預測值之間的偏差率相對較小，說明驗證試驗的預測值和實測值之間相吻合，星點設計-響應面優化試驗有較好的預測效果。

2.5紅豆蛋白特性測定

2.5.1持水性測定。

圖2表明，紅豆蛋白的持水性受到溫度、離子強度、pH和蔗糖質量濃度的影響較為明顯。當pH等于4時，紅豆蛋白持水性降到最低，說明此時正處在紅豆蛋白的等電點附近，蛋白質處于兼性離子的狀態，其帶的凈電荷為零，蛋白質分子分散程度比較低，水化能力較小，因此持水性表現的最低。反之，離紅豆蛋白的等電點越遠，蛋白質所帶的凈電荷越多，蛋白質分子的靜電斥力就會增加、分散程度也越高，水化能力和持水性就會越強。在NaCl濃度為0～0.8 mol/L的范圍以內，紅豆蛋白的持水性隨著NaCl濃度的增大而增大，NaCl濃度為0.8 mol/L時達到了最大，原因是由于發生了“鹽溶”現象，使蛋白質帶的電荷增多，蛋白質的水化能力增強，持水性增加了；但是大于0.8 mol/L時則表現出下降趨勢，可能是發生了鹽析沉淀造成的。由于鹽類解離出的離子與水分子的結合，降低了蛋白質水合作用，從而降低蛋白質的持水性。蔗糖質量濃度在0～50 g/L的范圍內，紅豆蛋白持水性一樣表現出隨著蔗糖質量濃度增大而增大，這可能是因為蔗糖分子中有大量的羥基能夠吸引和保持水分，增加了紅豆蛋白持水性。在60 ℃以下時，紅豆蛋白持水性會隨著溫度升高而增加，這是由于溫度增加把原本結構致密的蛋白質變性，其構象發生了改變，蛋白質分子解離和伸展以及適當升溫都有助于蛋白質分子與水分子相互作用；但是隨著溫度進一步的升高，蛋白質變性，分子內部的非極性基團大量暴露于外圍，使得蛋白質持水性下降。

圖2pH、離子強度、蔗糖質量濃度、溫度對紅豆蛋白持水性的影響

2.5.2 紅豆蛋白的乳化性及乳化穩定性。

蛋白質是食品以及保健品等行業中安全并且有效的乳化劑，它能夠降低水和油表面的張力，使它們容易乳化；另一方面，蛋白質分散在非連續相和連續相間的界面上，阻止非連續相聚積，可以有助于乳狀液的穩定。

由圖3可以看出，紅豆蛋白的乳化性和乳化穩定性都隨

圖3pH、離子強度、蔗糖質量濃度、溫度對紅豆蛋白乳化性及如化穩定性的影響

著pH和離子強度的變化趨勢和溶解度曲線保持一致，這可能是由于蛋白質乳化性與穩定性和蛋白質溶解度呈正相關造成的，當遠離紅豆蛋白等電點和“鹽溶”作用的影響，蛋白質溶解度比較強，蛋白質間的排斥力會增強，油滴更容易吸附到蛋白質的界面上[19]。可溶性蛋白質能擴散并且吸附到油—水界面是決定蛋白質乳化性質最重要的因素之一。當pH大于7、NaCl濃度大于0.8 mol/L時，紅豆蛋白的乳化性與乳化穩定性出現下降趨勢，這是由于蛋白質溶解度進一步增加引起的，可使膠體水化層變薄，蛋白質發生凝聚，降低了乳化性和乳化穩定性，同時溶解度較低時，沒有溶解的蛋白質顆粒對乳狀液的穩定起到了重要的作用[20]。蔗糖可以增加紅豆蛋白的乳化性和乳化穩定性，隨著蔗糖質量濃度的增大而有小的增加幅度，這是因為蛋白質通過在油滴界面形成了一層薄膜而產生立體阻礙效應以達到穩定乳狀液，添加蔗糖改變了水相介質的流變特性，升高了體系黏稠度，并和蛋白質發生交互作用使得乳狀液穩定[21]。紅豆蛋白乳化性隨著溫度的變化趨勢和其溫度—溶解度曲線相吻合，這可以證明可溶性是蛋白質有乳化性質的先決條件，只有蛋白質具有一定的溶解度，才能有效地向油-水界面擴散。隨著溫度的升高，紅豆蛋白乳化性和乳化穩定性表現出先上升后降低的趨勢，在60 ℃時表現出最大的乳化性和乳化穩定性，這是因為適度加熱處理會使蛋白質分子伸展、溶解度增加，蛋白質之間排斥力的減小，會使油滴容易吸附到蛋白質界面上，促進蛋白的乳化能力；可是溫度過高會降低吸附到界面上蛋白質膜的黏度和硬度，因此乳化性和乳化穩定性會有所降低[19]。

2.5.3吸油性測定。

蛋白質的吸油性是指蛋白質和游離油脂互相的結合能力。對于食品風味，蛋白質吸油性是一項重要的功能特性，能夠提高食品對于脂肪的吸收和保留能力，減少脂肪在加工中的損失，從而提高食品的適口性和風。

圖4表明，紅豆蛋白的吸油性會隨著溫度升高而下降，原因可能是隨著溫度的升高，蛋白質分子漸漸解離和伸展以致變性，肽鏈伸展后會和高溫處理后發生氧化的油的中小分子產生作用[19]。

圖4溫度對紅豆蛋白吸油性的影響

2.5.4等電點測定。

在蛋白質的分子中，盡管各個氨基酸間是通過肽鍵連接的，但是其分子依舊有很多可以解離的基團，如氨基、酚羥基、羧基、咪唑基等，因而蛋白質為兩性電解質。調節溶液的pH，當蛋白質分子中帶有的正電荷數量和負電荷數量相等，因此靜電荷為零，在電場中不移動，此時溶液pH就是該蛋白質的等電點。

由圖5可知，pH等于3.6時，溶液中紅豆蛋白聚集沉淀，蛋白質含量達到最低，此時蛋白質分子中帶有的正電荷數量和負電荷數量相等，靜電荷等于零，即等電點是3.6。

圖5pH與紅豆蛋白濃度的關系

3結論

在單因素試驗處理的基礎上，通過CCD組合交錯試驗，得到超聲波輔助提取紅豆蛋白最佳工藝條件為：料液比為1∶11.2 g/ml、pH為7.2、超聲時間為52 min、溫度為51 ℃，提取率達81.20%。

當pH在等電點附近時，紅豆蛋白具有很好的持水性、乳化性和乳化穩定性。NaCl溶液的濃度在0～0.8 mol/L范圍內時，紅豆蛋白溶解性和持水性、乳化穩定性和乳化性與NaCl濃度的增加呈正相關，并且隨著鹽濃度增加而呈現下降趨勢。

加入蔗糖會增加紅豆蛋白的持水性，溶解性先下降后升高，在37 g/L時為最低，乳化性和乳化穩定性隨著蔗糖濃度增大而稍有增加，但是增加幅度并不大。溫度在20～60 ℃范圍以內時，紅豆蛋白持水性和乳化性以及乳化穩定性會隨著溫度升高而增大，在60 ℃時達到最大值；溶解性和吸油性在50 ℃時達到最大值，并且隨溫度的進一步升高均表現出下降趨勢。

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