施氏鱘腫嘴病快速檢測方法的研究*

劉雙鳳 鄒作宇 袁美云 董宏偉 呂延玲(哈爾濱市農業科學院水產分院，哈爾濱150028)

施氏鱘腫嘴病快速檢測方法的研究*

劉雙鳳 鄒作宇 袁美云 董宏偉 呂延玲
(哈爾濱市農業科學院水產分院，哈爾濱150028)

以施氏鱘(Acipenserschrenckii)腫嘴病病原菌異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)為抗原，免疫兔獲得高免血清，建立一種快速檢測施氏鱘腫嘴病病原菌的ELISA技術。結果顯示:采用棋盤滴定法確定抗原和抗血清的最適工作濃度分別是為107CFU和1∶100000;病原菌檢測靈敏度為每孔104CFU;抗血清與其它細菌標準菌株的交叉反應均呈陰性;阻斷試驗中的阻斷率達67.3%;交叉反應和阻斷試驗的結果表明該方法具有較高的特異性。將此方法標準化后，對35份人工感染后的施氏鱘和健康施氏鱘進行檢測，陽性的檢出率分別為88.6%和14.3%，表明該技術不但可以檢測已經發病的施氏鱘，而且還可以檢測帶菌的施氏鱘。

施氏鱘;腫嘴病;異常嗜糖氣單胞菌;間接ELISA

施氏鱘(Acipenserschrenchii)屬于鱘形目，鱘科，鱘屬，主要分布在黑龍江省，具有獨特的食用價值、經濟價值和良好的繁殖性能，是中國鱘魚的主要養殖品種之一。近年來由于其人工養殖技術迅速的發展，黑龍江、北京、遼寧、湖北、廣東、江西、貴州、重慶等許多省市成功地開展了鱘魚人工養殖［1］。隨著鱘魚養殖規模的擴大，密度增加，施氏鱘魚頻繁暴發大規模的疾病。其中，細菌性敗血癥、腸炎、腫嘴病最為突出，已嚴重影響到鱘魚產業的健康發展［2］。細菌性腫嘴病癥狀主要表現在在病魚口部四周充血、腫脹，不能活動，攝食困難，口部和體表伴有水霉著生，肛門紅腫，剖檢后發現在腸道內少量食物或無食物，肝腫大。該病在20cm以下的幼鱘階段發生較多，可造成幼鱘死亡。該病傳播速度快、流行廣、經濟損失較重。經實驗室分離出該病病原菌并通過人工感染試驗證明，即為施氏鱘魚腫嘴病病原菌。對該病原進行生理生化鑒定和16srRNA基因序列同源性分析，確定為氣單胞菌屬中的異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)。

在魚類的致病菌中，氣單胞菌是主要的致病菌之一。其中，嗜水氣單胞菌［3－5］、維氏氣單胞菌［6］、豚鼠氣單胞菌［7］均可感染鱘魚引起疾病的發生，給鱘魚養殖業造成重大的經濟損失。本研究以施氏鱘腫嘴病病原菌異常嗜糖氣單胞菌為研究對象，建立間接ELISA檢測技術，以期為養殖鱘魚腫嘴病的快速檢測提供可以使用的方法，并為開發診斷該病的試劑盒提供理論基礎和實驗資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用菌株——試驗用菌分離于患腫嘴病施氏鱘并鑒定。遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、大腸肝菌(Escherichiacoli)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)由大連水產學院微生物實驗室惠贈。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

試驗動物——純種新西蘭白兔購于哈爾濱羅來生物科技發展有限公司實驗動物事業部;回歸感染試驗用的施氏鱘魚由哈爾濱市農業科學院水產分院提供。

試驗試劑——免疫用弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購于美國Sigma公司;酶標抗體、兔陰性血清購自北京Solarbio科技公司，工作濃度為1∶1000。

1.2 抗原的制備

試驗方法參照樊景鳳［8］，將異常嗜糖氣單胞菌接種于普通營養瓊脂平板培養基上，30℃培養24h后，用無菌的生理鹽水清洗脫、離心、洗滌后，加入甲醛溶液滅活，(終濃度達0.5%)。24h后，運用菌落計數法檢測滅菌效果。離心機4000r/min離心5min后，去掉上清液，用滅菌的生理鹽水洗滌3次后，用顯微鏡血球計數板計菌數，配制出濃度約為1× 108CFU/mL的菌懸液作為免疫家兔的抗原。弗氏佐劑與菌懸液1∶1比例混合，用兩只注射器分別吸入相同體積的弗氏佐劑與菌懸液，無菌操作用無菌軟件管連接后反復推拉，最后液體變成油包乳狀后(滴到水里不散開即可)，抗原制備完成。

1.3 抗血清的制備

選擇2只1.5kg左右的健康新西蘭未孕雌兔，背部皮下6點注射免疫，分4次免疫，免疫間隔周期為7d，最后一次免疫7d后，耳靜脈采血，析出血清后，用試管凝集法測定抗體的效價及交叉反應的效價，效價達到1∶1280以上即可使用。有交叉反應的菌株，在免疫的血清中加入過量的該菌細胞，混合均勻后，冰箱里4℃過夜，再用離心機離心、過濾除掉該菌。過濾后的血清經過交叉反應測定后如無交叉反應，即可以分裝，保存于－20℃冰箱中備用。

1.4 間接ELISA方法的建立

1.4.1 間接ELISA檢測程序步驟

用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(PBS)稀釋異常嗜糖氣單胞菌抗原，加入96孔聚苯乙烯酶標反應板的孔內，100μL/孔，干燥箱60℃烘干;用PBST緩沖液洗滌3次后;每孔加入5%脫脂乳－PBST封閉液，300μL/孔，37℃培養箱中封閉1h;洗滌3次;加入適當稀釋的陽性血清和陰性血清，100μL/孔，37℃培養箱中孵育1h;洗滌3次;加入羊抗兔IgG－HRP酶標抗體，100μL/孔，37℃培養箱中孵育1h;洗滌3次;加新配制的OPD－H2O2底物溶液，100μL/孔，37℃培養箱中避光孵育10min;加入2mol/LH2SO4終止反應，50μL/孔;10min后用酶標儀OD492下讀值，進行結果判定。

1.4.2 確定抗原和抗體最適工作濃度

采用棋盤滴定法，具體過程如下:將108CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌懸液從1∶10至1∶10000做倍比稀釋，每個稀釋度包被2孔，100μL/孔;干燥箱60℃烘干;把陽性血清按1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000、1∶30000進行稀釋，按與抗原濃度變化垂直的方向加入各個板孔，100μL/孔，培養箱37℃放置1h;酶標抗體作1∶1000稀釋，按以上步驟進行間接ELISA測定。酶標儀讀值，以能產生OD492值1.0左右，且P/N值最大的抗原抗體稀釋度為最佳稀釋度;設空白對照，加樣順序為:包被抗原——封閉液——底物。

P/N=(陽性對照OD492值－空白對照OD492值)/(陰性對照OD492值－空白對照OD492值)

1.4.3 免疫血清敏感性試驗

將109CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌菌懸液從1∶10至1:1000000做系列稀釋，每個稀釋度包被2孔(100μL/孔)，干燥箱60℃烘干，將血清稀釋到最適工作濃度后，以確定最小的抗原檢測濃度。酶標儀讀值，以產生OD492值接近1.0，且P/N值≥2.1判為陽性。

1.4.4 特異性實驗

交叉實驗:用濃度均為107CFU/mL的嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維氏弧菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、豚鼠氣單胞菌包被酶標反應板，血清采用最適稀釋度，檢測是否有交叉反應情況。

阻斷實驗:將107CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌菌液包被酶標反應板，將陽性血清從1∶200開始做倍比稀釋，各稀釋度分別加入等量的異常嗜糖氣單胞菌菌液，混勻后于37℃培養箱中放置1h，同時對照是不做任何處理的抗異常嗜糖氣單胞菌的陽性血清和陰性血清，進行間接ELISA測定，測定其阻斷率。計算其抑制率的公式為(N－T/N)，N是未經處理異常嗜糖氣單胞菌的陽性血清的OD492值，T為經過處理的陽性血清的OD492值。

1.4.5 重復性實驗

取陽性血清做1∶1000稀釋，隨機加到酶標板孔中，作間接ELISA測定，酶標儀讀值后，計算出平均OD492值與標準差(SD)，之后計算板內變異系數(CV)，公式如下:CV%=SD/平均OD492值× 100%。然后同樣血清在隨機5塊板上，做如上重復測定。然后根據OD492值，計算出每份血清的板間變異系數。

1.5 間接ELISA檢測方法的應用

取人工感染試驗患腫嘴病的施氏鱘魚及健康施氏鱘魚各35條，解剖后將其肝、腎、嘴等組織用5倍體積的無菌PBS勻漿，離心機4000r/min，離心后取上清液60℃1h滅活，放4℃冰箱備用。用間接ELISA程序檢測，將離心處理后的上清液直接包被酶標板，100μL/孔，2個平行，以下方法同1.4。

2 結果

2.1 間接ELISA抗原和抗血清最適工作濃度的確定

不同稀釋度包被抗原與1∶25000稀釋的陽性血清作用所得的OD492值如表1所示，由于抗原在作1∶100稀釋時OD492值接近1.0，且P/N值最大，所以確定包被抗原的最適工作濃度為107個/mL。

表1 抗原最適包被濃度的確定

如表2所示，取抗原最適包被濃度1× 107CFU/mL，當免疫血清作1∶10000稀釋時，酶標儀讀取的OD492值趨近于1.0同時P/N值最大，所以確定免疫血清的最適稀釋度為1∶10000。

表2 最適血清工作濃度的確定

2.2 免疫血清敏感性試驗結果

以最適稀釋度血清(1∶20000)檢測抗原靈敏度，結果見表3。從表3可見，用間接ELISA測得免疫血清能檢到的異常嗜糖氣單胞菌株最低濃度為104CFU/mL。每孔為103CFU。

表3 免疫血清敏感性試驗結果

2.3 特異性實驗

2.3.1 交叉實驗

檢測金黃色葡萄球菌、遲鈍愛德華氏菌、屈撓桿菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌與抗異常嗜糖氣單胞菌陽性血清交叉反應情況，異常嗜糖氣單胞菌作對照，結果顯示只有異常嗜糖氣單胞菌呈陽性，其余細菌均呈陰性(表4)。

表4 免疫血清交叉實驗結果

2.3.2 阻斷實驗

經過異常嗜糖氣單胞菌處理過后的陽性血清隨著稀釋度的增加，由表5可看出，OD492值明顯下降，并逐漸接近陰性水平;而未經異常嗜糖氣單胞菌處理的陽性血清隨著稀釋度的增加OD492值緩慢下降。阻斷率最高為67.30%，說明該陽性血清對異常嗜糖氣單胞菌具有特異性。

表5 免疫血清阻斷實驗結果

2.4 重復實驗結果

板內變異系數(CV)值為0.053，SD=0.0417，平均OD492值為0.7867，CV=5.3%。板間變異系數(CV)值為0.07998，SD=0.01955，平均OD492值為0.7971，CV=1.955%。板內變異系數和板間變異系數均小于10%，說明本批次酶標反應板的吸附性能較好。

2.5 ELISA檢測方法的臨床應用

患腫嘴病的施氏鱘進行間接ELISA檢測，如果如表6所示，陽性檢出率為88.6%，而健康施氏鱘魚的陽性檢出率為14.3%。

表6 施氏鱘魚的間接ELISA檢測結果

3 討論

在施氏鱘幼魚養殖過程中，主要發生的細菌性疾病有四種，即細菌性敗血癥、腸炎病、腫嘴病、爛鰓?。?］。其中，由于細菌性腫嘴病與敗血癥、腸炎病在疾病發生初期魚體外觀上的病癥表現相似，不易區分，但致病菌卻不同，因此更需要對施氏鱘魚腫嘴病進期早期診斷，準確判斷病原菌，并進行相應的抗菌治療，以免因誤診而帶來不必要的經濟損失。傳統的魚類疾病診斷方法主要是從魚患病處分離疑似致病菌，并對該細菌(有可能是幾種)的形態特征、生理生化特征等進行分析，需要時間長且工作量大，目前已經不能滿足鱘魚疾病防治的需要，而PCR技術雖然具有特異性好、檢測速度快且靈敏等優點，但是費用較為昂貴，對人員的實驗技能要求較高，同時所選基因的特異性與重復性也受到主觀因素的影響，不太適于基層和臨床中的病原快速鑒定，所以限制了該方法在實際中的應用。因此，建立準確、靈敏、快速的診斷方法很有必要［10］。酶聯免疫吸附法(Enzyme LinkedImmunosorbentAssay，簡稱ELISA)是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性免疫反應及酶對底物的高效催化反應作用相結合敏感性很高的試驗技術。具有特異性強、敏感性高、操作方便、可重復性強、等優點，比較常用的是ELISA雙抗體夾心法和ELISA間接法，經常被應用于水產病害檢測、診斷等方面，目前嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、溶藻弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌等水產病原菌［11－15］已建立了間接ELISA檢測技術，但是施氏鱘腫嘴病的間接ELISA檢測方法在國內尚屬首次報道。本方法的建立對于施氏鱘魚腫嘴病的早期診斷，有效預防疾病發生，降低養殖成本有著重要意義。

在鰻鱺病魚中分離到了該菌——異常嗜糖氣單胞菌［16］，導致鰻鱺爛尾、腹腔腫大，解剖后肝腎充血腫大而死亡，且人工感染試驗死亡率達到100%。本研究表明此菌在施氏鱘中是首次分離得到，感染試驗結果表明該菌可造成施氏鱘魚腫嘴病的發生。因此在水產養殖中應給予一定的重視。

將該方法流程確定各種準確的參數后，對健康施氏鱘和人工感染腫嘴病并發病的施氏鱘進行檢測，陽性檢出率分別為14.3%和88.6%，表明該技術能夠較好的檢測已經被異常嗜糖氣單胞菌感染發生腫嘴病的施氏鱘，也能夠檢測沒發病但是攜帶致病菌的施氏鱘，這對于鱘魚養殖業的早期診斷有著重要意義。本研究所建立的鱘魚腫嘴病間接ELISA技術具有特異、快速、準確度高等優點，為施氏鱘幼魚養殖過程中腫嘴病病原菌的檢測提供快速準確的檢測方法，并為施氏鱘腫嘴病病原菌的ELISA快速檢測試劑盒的研制提供科學依據，具有較強的實際應用意義，對進一步制定該病的防治方法具有重要的指導意義。

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S941.42

A

1006－3188(2015)01－0003－06

2015－03－18

哈爾濱市科技局青年科技創新人才(2012RFQYN028)

劉雙鳳(1980－)，女，助理工程師，碩士，主要從事水產養殖及水產動物疾病方面的研究。E－mail:47817941@qq.com