花生栽培品種轉錄因子基因DREB1的克隆及表達載體構建

李文　劉風珍　萬勇善等

摘要：本研究從33個花生栽培品種中克隆獲得干旱脅迫響應轉錄因子基因PNDREB1，經序列分析發現，33個栽培品種PNDREB1的核苷酸序列同源性為100%，并構建了植物表達載體pGBDREB1，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生；DREB1；植物表達載體

中圖分類號：S565.2：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0006-04

Abstract In this research， drought stress responsive transcription factor gene PNDREB1 were cloned from 33 peanut cultivars. Sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology of PNDREB1 from 33 peanut cultivars was 100%. The plant expression vector pGBDREB1 was also constructed， which laid foundations for further research of the gene.

Key words Peanut； DREB1； Plant expression vector

花生（Arachis hypogaea L.）是我國重要的經濟作物和油料作物，在國民經濟中占重要地位。我國花生產區主要分布于干旱半干旱的丘陵地區，花生生長期間常受到不同程度的干旱脅迫，嚴重影響其生長發育和產量[1]，是花生生產的首要限制因子。

干旱應答元件結合蛋白（dehydration responsive element binding protein，DREB）屬于AP2/EREBP（乙烯應答元件結合蛋白）家族，含有高度保守的AP2區域，該區域特異性地與啟動子中的DRE/CRT順式作用元件結合，激活逆境相關基因的表達，提高作物的抗性。自Liu等[2]從擬南芥中分離到轉錄因子基因DREB1A和DREB2A，并發現該類基因的過表達可以有效提高轉基因植物的抗逆性以來，DREB基因已經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。在水稻[3]、小麥[4]、玉米[5]、高粱[6]、白菜[7]、棉花[8]等作物中陸續有多個DREB基因被分離鑒定。Wang等[4]將DREB基因轉化到小麥中，轉基因小麥抗旱性明顯升高，脯氨酸含量是對照的2倍。王曉飛[9]將大豆DREB基因轉化到擬南芥中，發現干旱脅迫下轉基因植株抗旱性增強，其脯氨酸含量、可溶性糖含量升高，丙二醛含量降低。

張梅等[10]從花生栽培品種魯花14未成熟種子的cDNA文庫中分離到一個DREB類基因——PNDREB1（FM955403）。該基因序列長度為687 bp，推測編碼蛋白含有229個氨基酸殘基，其AP2結構域具有和DRE元件特異性結合的能力，其C-末端片段具有轉錄激活活性，利用半定量RT-PCR技術進行基因表達模式分析顯示，PNDREB1為組成型表達，能夠被低溫強烈、迅速誘導表達，對干旱脅迫也有一定程度的響應，但不能響應高鹽和ABA信號。本研究克隆了33個花生栽培品種的DREB1基因，對其進行了序列多態性分析，并構建PNDREB1超表達的植物表達載體，為今后通過遺傳轉化進一步了解花生DREB1在響應干旱脅迫中的功能提供材料依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試材料為33個花生栽培品種（表1），由山東農業大學花生研究所提供。

植物表達載體pGBVE質粒和農桿菌菌株LBA4404由本實驗室保存。限制性內切酶BamH Ⅰ購自Fermentas公司；限制性內切酶NotⅠ和T4 DNA連接酶購自Thermo公司。TIANgel膠回收試劑盒、TIAN prep質粒小提試劑盒、RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant RT Kit（with gDNase）購自天根生化科技有限公司；pEASY-T1 Vector、大腸桿菌菌株Trans1-T1、Eazy Taq高保真酶購自北京全式金生物技術有限公司；DL2000和DL5000 DNA Maker購自大連寶生物生物工程有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。引物由上海生物工程有限公司合成，測序由北京六合華大基因科技有限公司進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生葉片總DNA提取 采用CTAB法提取花生幼嫩葉片的基因組DNA。

1.2.2 花生葉片總RNA提取 按照天根植物總RNA提取試劑盒的說明書并加以優化提取花生葉片總RNA，并用試劑盒反轉錄成cDNA。

1.2.3 花生DREB1基因的擴增 根據花生PNDREB1（FM955403）序列設計引物[9]DREBF：5′-ATGGACGTGGACCCG C-3′，DREBR：5′-GTTAGTAGGGAACTGACT CC-3′；以33個栽培品種基因組DNA和cDNA為模板，擴增PNDREB1的基因序列。PCR程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 50 min，35個循環；72℃ 10 min。

1.2.4 PCR產物的克隆測序 PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，按照DNA膠回收試劑盒說明書回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α中進行抗卡那霉素篩選。挑選陽性單菌落，PCR檢測鑒定后送北京六合華大基因科技有限公司測序，每個栽培品種選6～7個克隆。

1.2.5 PNDREB1植物表達載體的構建 以植物表達載體pGBVE為基礎，用限制性內切酶BamH Ⅰ和NotⅠ進行雙酶切，以PNDREB1基因片段代替γ-TMT（γ-維生素E甲基轉移酶基因）構建由組成型啟動子35S驅動PNDREB1表達的重組質粒。將重組質粒轉入到農桿菌LBA4404感受態細胞中，篩選鑒定得到陽性克隆。植物表達載體構建路線圖見圖1。endprint

2 結果與分析

2.1 PNDREB1基因的克隆

用引物DREBF和DREBR分別對山花11號基因組DNA和cDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測均獲得約700 bp的特異性條帶（圖2），經克隆、測序獲得PNDREB1的序列，PNDREB1基因全長687 bp，無內含子，編碼蛋白包括229個氨基酸。

分別以33個花生栽培品種的基因組DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，經克隆、測序檢測，每個栽培品種均得到一條PNDREB1 DNA序列，序列一致性為100%。

2.2 PNDREB1基因植物表達載體的構建及檢測

根據PNDREB1基因片段和pGBVE質粒序列特征以及pEASY-T1克隆載體所攜帶的限制性內切酶的種類，選擇BamHⅠ和NotⅠ作為雙酶切的限制性內切酶。酶切后pEASY-T1片段大小分別約為700 bp和3.9 kb，pGBVE分別為5 kb和2 kb，大小與預期相符。

將目的基因片段和質粒大片段分別回收、純化，用T4 DNA連接酶連接，重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質粒，用限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切鑒定和測序驗證，結果顯示PNDREB1基因的正向序列已經替換了pGBVE質粒上的γ-TMT基因（圖3），花生DREB1的過表達載體構建成功，命名為pGBDREB1。

重組質粒pGBDREB1以凍融法轉入農桿菌LBA4404感受態細胞中，篩選出陽性克隆。用引物DREBF/R對陽性單菌落進行PCR檢測，得到700 bp左右的特異性條帶（圖4），表明重組質粒轉化成功。

3 討論

本研究克隆到的PNDREB1基因，全長687 bp，無內含子，編碼229個氨基酸，與參考序列PNDREB1（FM955403）完全一致。花生栽培種是異源四倍體（AABB），由兩個具有不同染色體組的二倍體野生種通過自然雜交，再經一次性加倍事件進化形成[14]。本研究在每個栽培種花生中只分離到一條PNDREB1序列，且33個栽培品種序列高度保守，推測該轉錄因子在植物中行使著非常重要的功能。

根據PNDREB1基因片段和pGBVE質粒序列特征以及pEASY-T1克隆載體所攜帶的限制性內切酶的種類，本研究選用BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切，將γ-TMT基因切除，成功構建了帶有Bar基因、由組成型啟動子35S驅動的PNDREB1的植物表達載體pGBDREB1，并將重組載體導入根癌農桿菌LBA4404中，獲得了陽性菌株，可用于花生遺傳轉化試驗，為下一步研究PNDREB1基因的功能奠定了基礎，為花生的抗旱育種提供了材料。

參 考 文 獻：

[1]Nakashima K， Takasaki H， Mizoi J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica Biophys. Acta， 2012， 1819（2）： 97-103.

[2]Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors， DREB1 and DREB2， with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low-temperature responsive gene expression， respectively， in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 1998， 10（8）： 1391-1406.

[3]Chen J Q， Meng X P， Zhang Y， et al. Over-expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice[J]. Biotechnol. Lett.， 2008， 30（12）： 2191-2198.

[4]Wang J W， Yang F P， Chen X Q. Induced expression of DREB transcriptional factor and study on its physiologycal effects of drought tolerance in transgenic wheat[J]. Acta Genetica Sinica， 2006， 33（5）：468-476.

[5]Qin F， Sakuma Y， Li J， et al. Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J]. Plant Cell Physiol.， 2004， 45（8）： 1042-1052.

[6]謝登雷， 崔江慧， 常金華. 高粱中SbDREB2基因的克隆與表達分析[J]. 作物學報， 2013， 39（8）： 1352-1359.

[7]劉曉穎， 陳麗媛， 張競秋， 等. 白菜脫水應答轉錄因子BpDREB1基因的克隆及功能研究[J]. 作物學報， 2013， 39（2）： 230-237.

[8]李付振， 邱新棉， 劉傳亮. 棉花中一個新的類DREB轉錄因子（GhDREB2B）的克隆、序列特征及表達分析[J]. 浙江農業學報， 2010， 22（5）：564-569.

[9]王曉飛. 大豆GmDREB轉錄因子基因的功能與作用機制分析[D]. 北京：中國農業科學院， 2008.

[10]張梅， 劉煒， 畢玉平， 等. 花生中DREB類轉錄因子PNDREB1的克隆及鑒定[J]. 作物學報， 2009， 35（11）： 1973-1980.

[11]厲廣輝， 萬勇善， 劉風珍， 等. 不同抗旱性花生品種根系形態及生理特性[J].作物學報， 2014， 40（3）：531-541.

[12]厲廣輝， 張昆， 劉風珍， 等. 不同抗旱性花生品種的葉片形態及生理特性[J]. 中國農業科學， 2014， 47（4）： 644-654.

[13]張秀榮. 花生Cu/Zn-SOD基因分子特征及其表達差異分析[D]. 泰安：山東農業大學， 2013.

[14]Moretzsohn M C， Gouvea E G， Inglis P W， et al. A study of the relationships of cultivated peanut （Arachis hypogaea） and its most closely related wild species using intron sequences and microsatellite markers[J]. Annals of Botany， 2013， 111： 113-126.endprint