5株生姜促生菌的初步鑒定及產(chǎn)IAA和抑菌能力測(cè)定

王西祥+徐坤+張冬梅等

摘要：為明確5株生姜促生菌的分類地位和促生活性，本試驗(yàn)通過觀察其菌體及菌落形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，初步確定GJ3為解淀粉芽孢桿菌，GJ130為納什維爾鏈霉菌，NS87為非脫羧勒克氏菌，NS178為枯草芽孢桿菌，NS111為路德維希腸桿菌。用抑菌譜法測(cè)定了5株促生菌的拮抗特性，其中GJ3和NS178具有較廣的抑菌譜，對(duì)14種病原真菌均具有拮抗效果。Salkowski比色法定量測(cè)定了5株促生菌產(chǎn)吲哚乙酸能力，菌株NS111產(chǎn)吲哚乙酸能力最強(qiáng)，其發(fā)酵液IAA含量為148.80 mg/L 。

關(guān)鍵詞：生姜；吲哚乙酸產(chǎn)生菌；拮抗；16S rDNA

中圖分類號(hào)：S476. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0036-06

Abstract In this research， the thallus and colony morphology characters， physiology and biochemistry properties and 16S rDNA sequence of five ginger growth-promoting bacteria were observed and analyzed. The strain GJ3， GJ130， NS87， NS178 and NS111 were identified as Bacillus amyloliquefaciens， Streptomyces nashvillensis， Leclercia adecarboxylata， Bacillus subtilis and Enterobacter ludwigii respectively. In addition， the antibacterial capacities of five strains were determined by antibacterial spectrum method. Among which， the strain GJ3 and NS178 had extensive antimicrobial spectrum， which both showed antagonism effects on 14 kinds of pathogenic fungi. The indole acetic acid （IAA）-producing abilities of five strains were also measured using Slkowski colorimetry. The strain NS111 had the best IAA-producing ability， whose IAA content of the fermentation liquid reached 148.80 mg/L.

Key words Ginger； IAA-producing strain； Antagonism； 16S rDNA

促生菌是指能夠促進(jìn)作物生長的一類細(xì)菌、放線菌和真菌的統(tǒng)稱。目前，根據(jù)其來源不同主要分為兩類，一類是從植物根際分離得到的菌株；一類是從植物組織中分離得到的菌株。促生菌可以幫助植物從環(huán)境中攝入某種養(yǎng)分，進(jìn)行直接促生，也可以通過減輕或預(yù)防不良環(huán)境因素（如病原菌、重金屬等）給植物造成的傷害而間接促生[1]。促生菌的作用機(jī)制主要包括：（1）產(chǎn)信號(hào)物質(zhì)，如吲哚乙酸、細(xì)菌分裂素和乙烯；（2）產(chǎn)鐵載體、抗生素抑制病原菌；（3）非共生固氮，一些PGPR能促使共生固氮結(jié)瘤，從而間接促進(jìn)植株生長。然而，促生菌和植物的互作關(guān)系往往并不穩(wěn)定，成功的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)并不一定在田間原位成功[2]。這種不穩(wěn)定性源于不同環(huán)境條件對(duì)細(xì)菌生長造成的影響，從而制約其促生效果，包括地域、氣象、土壤性質(zhì)、植物特性或土著微生物活力等[3]。

近年來，國家越來越重視環(huán)境質(zhì)量，開發(fā)替代化學(xué)殺蟲劑的新型生物殺菌劑成為必然，1964年至今，針對(duì)生姜病害，曾經(jīng)試驗(yàn)過的拮抗微生物包括無致病力產(chǎn)細(xì)菌素的青枯病菌、熒光假單胞桿菌、放線菌、芽孢桿菌、噬菌體和木霉等[4]。徐瑩瑩等[5]從生姜根際土樣分離篩選出對(duì)姜瘟病有良好拮抗效果的HI6-8短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）、WF1弗雷德氏鏈霉菌（Streptomyees fradiae）和JW02-6勞倫鏈霉菌（Streptomyces laurentii）。王小兵等[6]從病區(qū)健康花生植株莖稈分離到1株對(duì)花生青枯病（Ralstonia solanacearum）有強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌BZ6-1，鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。李文英等[7]從香蕉根際土壤分離篩選了芽孢桿菌PAB-1、PAB-2，并測(cè)定了菌株制劑對(duì)香蕉幼苗生長、養(yǎng)分吸收利用和香蕉枯萎病防治的效應(yīng)。

盡管國內(nèi)外已經(jīng)分離到諸多促生細(xì)菌，但針對(duì)于生姜并且能在山東生姜產(chǎn)區(qū)很好定植的菌種資源未見報(bào)道。本文對(duì)從生姜土壤和組織中分離的5株促生菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化特性測(cè)定及16S rDNA序列分析，初步確定其分類地位，并測(cè)定其拮抗能力及產(chǎn)吲哚乙酸能力，以期為生姜專用生物肥料的研制提供了菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 5株供試菌株從泰安市邱家店生姜試驗(yàn)田分離得到，其中GJ3和GJ130分離于生姜根際土壤；NS87、 NS178和NS111分離于生姜塊莖。

指示菌：煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、甘草鏈格孢葉斑病原菌（Alternaria azukiae）、生姜莖腐病原菌（Pythium myriotylum）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、煙草炭疽病菌（Colletotrichum nicotianae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. cucumeris）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. niveum）、腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）、黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）、芹菜斑枯病菌（Septoria apiicola）、蘋果葉枯病菌（Rhizoctonia solani）、茄子黃萎病原菌（Verticillium dahliae）、牡丹根腐病原菌（Fusarium solani Sacc.）、青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）和瓜瘡痂枝孢霉菌（Cladosporium cucumerinum Ell.）等15種病原菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。endprint

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、Buffer、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

Eppendorf centrifuge 5810R 離心機(jī)（Eppendorf 公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；T-Gradient 96 PCR 儀（德國 Biometra 公司）；美國 UVP 凝膠成像系統(tǒng)；超低溫冰柜（Haier 公司）。

1.1.4 16S rDNA擴(kuò)增引物 正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT -3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 形態(tài)觀察 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]中的方法進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.2 生理生化特性測(cè)定 生理生化特性測(cè)定所需試劑參見文獻(xiàn)[8]，包括生長溫度（4℃、20℃、30℃、50℃、55℃、65℃）、耐鹽性（2%、5%、7%、10%）、接觸酶、V-P測(cè)定、甲基紅、水解明膠、碳源利用（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、乳糖、甘油、山梨醇、蔗糖）、氮源利用（賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、L-蘇氨酸、D-蘇氨酸）、淀粉水解、形成吲哚、檸檬酸利用等30項(xiàng)。

1.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 CTAB法[9]提取待測(cè)菌株的總DNA，并作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖溶液（Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2.0 μL，引物（5 μmol/L）各2.0 μL，模板（約50 mg/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加ddH2O定容至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min（30個(gè)循環(huán)），72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

將16S rDNA測(cè)序結(jié)果去載體后提交GenBank獲得登錄號(hào)為KC312154、KF958192、KC312155、KC312156和 KC312157，并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，根據(jù)菌株與數(shù)據(jù)庫模式菌株的同源性高低，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 抑菌譜試驗(yàn)

以15種病原菌為指示菌，利用平板對(duì)峙法測(cè)定供試菌的拮抗能力。在PDA平板中央接種指示菌，四周接種供試菌，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以菌落半徑與抑菌帶寬度確定供試菌的拮抗能力。

1.4 IAA定量測(cè)定

向含有L-色氨酸（200 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中接菌，28℃、180 r/min培養(yǎng)4 d。分光光度法測(cè)定菌懸液的OD600值，然后將菌懸液10 000 r/min離心10 min，取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30 min使其顯色，測(cè)定其OD530值。計(jì)算單位體積發(fā)酵液中IAA的含量。IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，采用分析純的IAA梯度稀釋制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株菌的形態(tài)學(xué)特征

5株菌的形態(tài)特征見表1。其中GJ3、GJ130、NS178為革蘭氏陽性菌；GJ3和NS178能產(chǎn)生芽孢。經(jīng)初步觀察，GJ130為放線菌，呈較長的細(xì)絲狀，與其它4株菌明顯不同。GJ3與NS178結(jié)構(gòu)形態(tài)最接近。顯微鏡下觀察每株菌都均勻分布、形態(tài)特征穩(wěn)定。

2.2 5株菌的生理生化特性分析

將5株菌的16S rDNA 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，各自選擇同源性最高的模式菌株。經(jīng)測(cè)定，5株菌與模式菌種的多數(shù)生理生化指標(biāo)特性相似，少數(shù)特性存在差異，如GJ3能利用乳糖而模式菌株M1（B. amyloliquefaciens）未測(cè)定，GJ3菌株V-P測(cè)定陽性，而模式菌株M1呈現(xiàn)不穩(wěn)定性；GJ130在55℃和65℃生長不穩(wěn)定，而模式菌株M2（S. nashvillensis）不生長；NS87能利用甘油，而模式菌株M3（L. adecarboxylata）不能利用甘油等，這些少數(shù)差異性特性可能是由于菌株生存的不同環(huán)境造成的，也可能與差異性表達(dá)有關(guān)。5株菌的主要生理生化特性見表2。

2.3 5株菌16S rDNA序列測(cè)定及相似性分析

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)以及生理生化特性，初步鑒定GJ3、GJ130、NS87、NS111、NS178分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、納什維爾鏈霉菌（Streptomyces nashvillensis）、非脫羧勒克氏菌（Leclercia adecarboxylata）、路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），相似度均達(dá)99%。

2.4 抑菌譜

對(duì)5株菌進(jìn)行了培養(yǎng)皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)，部分拮抗效果如圖2所示。依據(jù)供試菌對(duì)指示菌抑菌帶寬度（R2）與供試菌菌落半徑（Rl）比值，計(jì)算供試菌的拮抗能力（R2/R1）。依據(jù)拮抗能力：陰性記為“-”；02.5記為“++++”，抑菌圈直徑15 mm以上。5株菌的拮抗性能見表3。

抑菌譜測(cè)定結(jié)果說明GJ3和NS178均對(duì)10種以上的病原菌有拮抗作用，具有較廣抗菌譜，R2/R1在1.0和3.0之間，拮抗能力較強(qiáng)；GJ130和NS87對(duì)青枯病原菌和茄霜枯葉病病原菌有較好的拮抗效果。

2.5 菌株產(chǎn)IAA測(cè)定結(jié)果

經(jīng)Salkowski比色法測(cè)定，NS111菌株發(fā)酵液中IAA的含量為148.80 mg/L，其它菌株沒有檢測(cè)到吲哚乙酸的產(chǎn)生。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)5株生姜促生菌進(jìn)行初步鑒定，將GJ3確定為解淀粉芽孢桿菌，GJ130為納什維爾鏈霉菌，NS87為非脫羧勒克氏菌，NS178為枯草芽孢桿菌，NS111為路德維希腸桿菌，其中有兩株為芽孢桿菌。芽孢桿菌是應(yīng)用比較廣泛的一類生防微生物。一些研究表明，解淀粉芽孢桿菌還能產(chǎn)生抗菌蛋白、伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin）、芬薺素（fengycin）和桿菌霉素（bacillomycin）等抑菌物質(zhì)，抑菌譜廣，特別是對(duì)于霉菌有較好的抑制作用[10]。崔堂兵等[11]2007年對(duì)枯草芽孢桿菌BS-06抑菌譜進(jìn)行研究，其對(duì)5種病原菌有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為11.3～19.8 mm。劉瑩等[12]對(duì)分離的5株芽孢桿菌進(jìn)行了5種病原菌的皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)，只有50%抑菌直徑達(dá)到10 mm。GJ3、NS178的抑菌譜較廣，GJ3 的拮抗能力最強(qiáng)，50%抑菌圈直徑大于15 mm，抑菌效果明顯優(yōu)于上述分離菌株。GJ130為納什維爾鏈霉菌，對(duì)青枯病病原菌有較強(qiáng)拮抗作用。冉紅艷等[13]得到了相似的結(jié)果，他們2005年分離獲得的一株鏈霉菌SR-11對(duì)姜瘟病有拮抗作用。

Shoebitz等[14]2009年首次將分離鑒定的E. ludwigii作為生防菌，并測(cè)定了菌株產(chǎn)吲哚乙酸能力為30 mg/L。張振粉等[15]2011年從番茄產(chǎn)區(qū)采集疫病樣品并分離4株產(chǎn)吲哚乙酸菌株XA7、XB3、ZA14和ZHC11，培養(yǎng)液加色氨酸時(shí)，菌株分泌IAA的濃度為3.84～25.74 mg/L。Liu等[16]2012年在白三葉根際分離篩選3株勒克氏菌，菌株RW2分泌IAA量最高，為12.69 mg/L。Abd-Alla 等[17]2013年從小麥和玉米的根際土壤中篩選出12株鏈霉菌屬，產(chǎn)生IAA的最高水平為3.5～22.5 mg/L 。另有文獻(xiàn)報(bào)道植物激素IAA對(duì)艷山姜種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及活力指數(shù)均有提高[18]。本試驗(yàn)測(cè)定了路德維希腸桿菌NS111產(chǎn)吲哚乙酸量達(dá)到148.80 mg/L，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。

本研究報(bào)道的5株促生菌分離自生姜產(chǎn)區(qū)，更有利于其在生姜根際的定植，研究結(jié)果為生姜專用生物肥料提供了菌種資源。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]康貽軍， 程杰， 梅麗娟， 等. 植物根際促生菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2010， 50（7）： 853-861.

[2]Chanway C P， Holl F B. First year field performance of spruce seedlings inoculated with plant growth promoting rhizobacteria[J]. Canadian Journal of Microbiology， 1993， 39（11）： 1084-1088.

[3]Ahmad F， Ahmad I， Khan M S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities[J]. Microbiological Research， 2008， 163（2）： 173-181.

[4]嚴(yán)金平， 澤桑梓， 張火云， 等. 姜細(xì)菌性青枯病病原菌及其防治研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004（9）： 63-65.

[5]徐瑩瑩， 杜秉海， 丁延芹， 等. 生姜根際姜瘟病拮抗菌的篩選及鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44（1）： 79-83.

[6]王小兵， 駱永明， 劉五星， 等. 花生青枯病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定、抗菌活性及其田間防效[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)， 2011， 27（1）： 88-92.

[7]李文英， 彭智平， 楊少海， 等. 植物根際促生菌對(duì)香蕉幼苗生長及抗枯萎病效應(yīng)研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2012， 39（2）： 234-242.

[8]東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社， 2001.

[9]Sambrook J， Fritsch E F. Molecular cloning： Alaboratory manual[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989.

[10]Koumoutsi A， Chen X H， Henne A， et al. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2004， 186（4）： 1084-1096.

[11]崔堂兵， 劉煜平， 舒薇， 等. 枯草芽孢桿菌BS-06液體發(fā)酵生產(chǎn)農(nóng)用抑真菌素的初步研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2007， 19（10）： 78-80.

[12]劉瑩， 孫榮丹， 楊翔華， 等. 5株芽孢桿菌的分離鑒定、拮抗性試驗(yàn)與抑菌效價(jià)測(cè)定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006， 22（5）： 32-34.

[13]冉紅艷， 葛紹榮， 劉世貴， 等. 一株拮抗姜瘟病青枯假單胞桿菌的鏈霉菌的分離及鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2005， 45（3）： 325-328.

[14]Shoebitz M， Ribaudo C M，Pardo M A， et al. Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2009， 41（9）： 1768-1774.

[15]張振粉， 陳秀蓉. 牧草內(nèi)生枯草芽孢桿菌的功能多樣性及其16S rDNA鑒定[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 39（3）： 63-66.

[16]Liu X X， Lu R X， Wang X L， et al. Selection，identification and growth promotion of inorganic phosphorus-dissolving bacterial strains in rhizosphere of Trifolium repens[J]. Agricultural Biotechnology， 2013， 13（10）： 2058-2064.

[17]Abd-Alla M H， El-Sayed E A， Rasmey A M. Indole-3-acetic acid（IAA） production by Streptomyces atrovirens isolated from rhizospheric soil in Egypt[J]. J. Biol. Earth Sic.，2013（3）：182-193.

[18]曾亞軍， 周仕林. 植物激素對(duì)艷山姜種子發(fā)芽的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（26）： 1245-1248.endprint