長白山野生篤斯越橘根系內生菌資源調查

劉鳳紅　程顯好　顧亮等

摘要：為探討長白山野生篤斯越橘菌根的形態結構和內生真菌的分布特征及種類，通過壓片法對野生篤斯越橘菌根形態和內生真菌的分布進行了研究，并采用根段組織直接培養分離法和根段組織研磨培養分離法對根系內生真菌進行了分離培養，結合真菌形態和分子生物學方法對分離菌株進行了鑒定和多樣性分析。結果表明，野生篤斯越橘菌根侵染率高達75%；對菌絲的形態觀察得出，至少3類不同形態的內生真菌參與菌根的形成，粗菌絲形成致密的菌絲團，細菌絲形成疏松的菌絲團，疏松的粗菌絲貫穿細胞。兩種分離方法共分離得到175株內生真菌，其中150株經形態學和分子綜合鑒定為5屬8種，其中Phialocephala spp.是優勢屬，占菌株總數的68.57%。根段組織研磨培養分離法較根段組織直接培養分離法獲得的內生真菌多，細菌根較粗菌根多。研究獲得的大量內生真菌資源為進一步生物防治菌株的篩選、開發與利用奠定了基礎。

關鍵詞：野生篤斯越橘； 菌根； 內生真菌； 形態特征； 分子鑒定

中圖分類號：S476.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0041-06

Abstract The mycorrhizal morphology and distribution of endophytic fungi in wild Vaccinium uliginosum Linn. in Changbai Mountain were studied through tabletting method. The endophytic fungi were isolated through root segment culturing method and grinding method， and were identified and analyzed based on fungal morphology and molecular biology technique. The results showed that the mycorrhizal infection rate was as high as 75%. According to the morphology of hyphae， the wild Vaccinium uliginosum Linn. contained at least three kinds of endophytic fungi， among which， thick hyphae formed dense hypha body， loose thick hyphae ran through the cell and thin hyphae formed loose hypha body. A total of 175 strains of endophytic fungi were isolated. Through morphology and molecular identification， 150 strains were divided into 8 species in 5 genera， among which， Phialocephala spp. was the dominant genera with the frequency of 68.57%. The amount of endophytic fungi isolated by root segment grinding method was larger than that of root segment culturing method， and that isolated from thin mycorrhiza was larger than that from thick mycorrhiza. The isolation of plentiful endophytic fungi laid foundations for further screening， development and utilization of bio-control strains.

Key words Vaccinium uliginosum Linn.； Mycorrhiza； Endophytic fungi； Morphological characteristics； Molecular identification

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉灌木，沒有根毛，為淺根系植物，果實為藍紫色小漿果[1，2]。研究表明，越橘果實中花青素含量是所有水果與蔬菜之最[3]，花青素具有抗氧化、抗癌和改善視力等巨大的保健價值[4]，此外，越橘還含有尼克酸、黃酮等特殊成分，因此常被譽為“漿果之王”[3]。由于具有豐富的營養保健價值，越橘在我國乃至世界的栽培規模不斷擴大，已成為最具發展潛力的果樹樹種之一[5]。目前，我國栽培的越橘品種均引自國外，國內豐富的野生越橘資源未能得到有效的利用。東北的篤斯越橘作為我國重要且極具經濟價值的野生越橘資源之一[6]，其改良和馴化均未取得理想的成果，越橘菌根共生學方面的基礎研究將為野生越橘資源改良和馴化提供必要的理論和實踐支撐。

在自然條件下，越橘根系與菌根真菌共生形成杜鵑類菌根（Ericoid Mycorrhizal Fungi，EMF），又稱歐石楠類菌根[1]。杜鵑類菌根真菌在緩解根系對水分及營養吸收能力低、植物對逆境因子抗性能力偏弱等問題上具有極其重要的作用[7]。在人工栽培條件下越橘根系和菌根真菌的共生需要較長的時間，且侵染率極低，有研究表明人工接種有效的菌根真菌將會顯著促進越橘的生長發育[8]。因此根系真菌的分離純化這一工作將有望解決野生篤斯越橘的移栽、馴化與改良等問題。endprint

本研究對長白山地區野生篤斯越橘菌根的形態結構和分布特征進行初步觀察，并對其根系內生真菌進行了分離與鑒定，為篤斯越橘菌根生態學研究及內生真菌資源合理開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 試驗材料為長白山野生篤斯越橘菌根。長白山自然保護區海拔1 300 m以下的篤斯越橘部分生長在泥炭蘚沼澤草甸子里，部分生長在苔蘚層較厚的落葉松林下。調查樣地中心點位于N 43°08′27″、E 127°02′16″，距圓池入口西側約9.5 km、邊防公路北約1.8 km處。取樣時輕輕去掉根系表面附著的苔蘚枯死殘留物，將健康的根連同泥土一并裝入無菌采樣袋，帶回實驗室立即進行處理。

1.1.2 培養基 內生真菌的分離與純化使用MEA培養基，保藏使用PDA培養基。

MEA培養基：麥芽浸膏3%、大豆蛋白胨0.3%、葡萄糖2.0%、瓊脂1.5%、蒸餾水定容至所配體積。

PDA培養基：馬鈴薯20.0%（煮汁過濾）、葡萄糖2.0%、瓊脂1.5%、蒸餾水定容至所配體積。

MEA培養基和PDA培養基在滅菌之前均將pH調至5.7，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后待培養基溫度降至60℃左右，向培養基中加入青霉素（50 μg/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理 挑取新鮮、健康的根，將根上的苔蘚、土壤清洗干凈，根據不同的試驗選擇不同粗細的根。

1.2.2 菌根染色、形態觀察 將選取的根切成1 cm長小段，用軟化酸處理后于FAA固定液中固定。采用以下方法染色觀察[9]：（1）組織透明：將根放入裝有10% KOH溶液的試管中，并將試管置于80℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，對根樣進行透明處理；（2）漂洗：倒掉KOH溶液，用蒸餾水沖洗3次；（3）酸化：在室溫條件下用5%雙氧水浸泡15 min，倒出雙氧水溶液，再用5%鹽酸浸泡10 min， 倒掉鹽酸溶液；（4）染色：向試管中加入適量臺盼藍溶液，同時將試管置于80℃恒溫水浴鍋中染色2 h；（5）脫色：染色完成后，取出根樣在乳酸中脫色10 min；（6）鏡檢：將脫色后的根放到滴有乳酸的載玻片上，蓋上蓋玻片進行光學顯微觀察。

用鑷子挑取粗細均勻的根段，剪成約0.5 cm長小段，共100個根段，每5個根段整齊排列于滴有乳酸的干凈載玻片上，蓋上干凈蓋玻片，用光學顯微鏡觀察，記錄菌根的菌絲形態與分布及每個根段的侵染情況。

1.2.3 侵染率計算方法 按照根段頻率標準法測定菌根侵染率[10]，即根據每段根系存在菌根結構的長度占根段總長度的百分比（沒有菌根結構的根段侵染率為0，整條根段都被侵染的為100%，只有一半長度被侵染的為50%），按0、10%、20%、……、90%、100%的侵染程度計算根段侵染率，并記錄各種侵染率下的根段條數，然后按照下列公式計算該樣品的侵染率：

侵染率（%）=[∑（0×根段數+10%×根段數+20%×根段數+……+90%×根段數+100%×根段數）]/總根段數

1.2.4 內生真菌的分離 將根樣分成粗和細兩種類型，并分別轉移至兩個培養皿中。

根段表面消毒：（1）細根：向裝有細根的培養皿中倒入10%雙氧水浸泡8 min后，用無菌鑷子將根轉移至無菌培養皿（每次加入溶液或洗根之前都重復此操作）中，無菌水洗3遍，再倒入6%的次氯酸鈉消毒1.5 min，再用無菌水洗5遍，最后用無菌濾紙吸干，待用；（2）粗根：步驟同細根的消毒方法，僅改變消毒的時間，10%雙氧水消毒10 min， 6%次氯酸鈉消毒2 min。分別將消毒后的粗根和細根剪成0.3～0.5 cm長的根段。

內生真菌的培養：（1）根段直接分離培養：每個培養皿中放置4個根段，將根段用消毒過的鑷子輕壓進培養基，模擬內生真菌在土壤中的環境，有利于營養的吸收。將培養皿置于20℃培養箱中黑暗培養2～3周。粗根和細根分別重復25次。（2）組織研磨分離培養：向研缽中加入100個根段和少量無菌水，充分研磨后，用移液槍取適量研磨溶液至培養皿中，再向培養皿中倒入降溫到60℃左右的培養基，輕微平搖培養皿使研磨溶液均勻分布于培養基中。粗根和細根分別重復25次。

內生真菌的純化：在無菌條件下用接種針挑取菌絲至MEA培養基中，每個菌落在同一平板內點3個菌斑，20℃黑暗培養2周后看菌落形態、生長速度等是否一致，若不一致，繼續進行二次純化。

內生真菌的篩選：純化完成后，將所有菌落都接種到PDA培養基上，一個菌落點1個菌斑，做3個重復，于20℃黑暗培養2周，若菌株都能生長，則進行形態鑒定；若出現部分不能生長的菌株，只有一個菌株時，該菌株就作為最終分離篩選的結果，而數量較多時，就只在MEA培養基上進行形態鑒定與篩選。對篩選出來的菌落特征進行描述與記錄，主要包括菌落直徑、顏色、質地等形態特征。記錄完成后挑取菌落邊緣菌絲，經處理后在光學顯微鏡下觀察菌絲體、孢子、孢子梗等，進行形態鑒定。不能明確鑒定的菌株，進一步進行分子鑒定。

1.2.5 DNA的提取與序列測定 根系內生真菌培養及DNA提取參考莊彩云等[11]的方法；根系內生真菌菌株rDNA ITS區段的PCR擴增、產物純化參考李潞濱等[12]的方法；PCR擴增產物直接送北京華大基因發展有限公司切膠純化測序。

1.2.6 內生真菌的鑒定 真菌鑒定依據形態特征和ITS序列分析相結合的方法。菌種經純化鑒定后，接入保藏培養基PDA斜面，于魯東大學農學院微生物菌種保藏室4℃冰箱中保藏。

2 結果與分析

2.1 長白山野生篤斯越橘菌根著生狀態

2.1.1 菌根侵染形態 根外菌絲：在所觀察的部分野生篤斯越橘根系表面，根外的菌絲較為常見，比較常見的有兩種類型，一種是細的菌絲，通常能密集包裹、纏繞在整個根系表面（圖1A）；另一種是較粗的有隔菌絲，比較稀疏的分布在根系表面（圖1B、C）。endprint

內生真菌菌絲：在野生篤斯越橘根系內觀察到了三類不同形態的內生真菌菌絲，在細胞間游走的菌絲（圖1F、G）、細胞內菌絲團（圖1D、E）和貫穿細胞的菌絲（圖1H）。在細胞間隙游走的菌絲以粗菌絲為主，菌絲都有隔，但是形態有所不同，有的較為規則地沿著細胞間隙縱向生長（圖1G），有的則不規則、彎曲地貼著細胞生長（圖1F）；細胞內菌絲團同根外菌絲一樣，也有粗和細兩種菌絲體，粗菌絲形成致密菌絲團（圖1D），會明顯撐大所侵染的細胞，在顯微鏡下菌絲膨大成泡囊狀，細菌絲則形成疏松的菌絲團（圖1E），不會明顯影響細胞的形狀；貫穿細胞壁的菌絲較少見。除了以上三類內生真菌菌絲外還觀察到了根細胞內正在降解的菌絲（圖1I）。

2.1.2 菌根侵染率 經觀察與統計，長白山野生篤斯越橘菌根侵染率達到75%，且帶有根尖的根段侵染率普遍較低。

2.2 內生真菌的分離

2.2.1 不同分離方法、粗細根樣對內生真菌分離效果的影響 內生真菌分離試驗結果（表1）顯示，從粗根和細根分離的結果來看，粗根中分離得到62個菌株，細根分離得到113個菌株，細根分離到的菌株數明顯高于粗根的菌株數。從分離方法上看，根段組織直接培養分離法得到74株菌株，根段組織研磨培養分離法獲得101株菌株，根段組織研磨培養分離法優于根段組織直接培養分離法。

2.2.2 菌株形態特征 將分離到的175株內生真菌根據其形態特征差異分為12類，各類菌株形態描述如表2。

2.3 內生真菌分類

分離得到的175株內生真菌，其中150株經形態學和分子綜合鑒定為5屬8種（表3）；另外25株無法命名到屬。Phialocephala spp.是優勢屬，占菌株總數的68.57%。

3 結論與討論

3.1 長白山野生篤斯越橘菌根著生狀態

從顯微觀察結果來看，長白山野生篤斯越橘菌根的菌絲形態多樣，根外菌絲與根內菌絲的形態具有一致性，同時根外菌絲從稠密程度上明顯高于根內菌絲，這為人工接種內生真菌提高侵染率提供了理論依據[11]。在表皮細胞內觀察到的粗菌絲形成致密的菌絲團，在一定程度上改變了細胞的形狀，這種變化可以增加營養吸收的面積還是會對表皮細胞造成一定的危害，尚需要進一步試驗求證。長白山野生篤斯越橘內生真菌的侵染率達到了75%，這對于分離多種多樣的內生真菌提供了豐富的資源。有試驗表明菌根真菌能侵染中柱[2]，由于本試驗未做越橘菌根的橫切片，只對毛根處理后直接壓片，未能見到侵染中柱的真菌，該方面還需要進一步研究。

3.2 內生真菌的分離

從本次試驗結果來看，細根不論是從分離菌株數量上，還是種類上明顯多于粗根，其中粗根分離的菌株菌絲的顏色主要以灰黑色和白色為主，而細根則以灰黑色為主。細根與粗根本質上是根齡不同，說明分離出的白色菌株侵染性比較持久或者是白色菌株專性侵染根齡較長的根系。從細根的顯微鏡觀察中看到正在降解的菌絲可以推測，造成細根分離出的菌株多于粗根的原因可能是某些種類的內生真菌到了一定的時間就會降解，造成根齡較長的菌根分離出來菌株的數量和種類較少。

無論從分離出菌株的數量還是種類上，采用根段組織研磨分離法分離出來的菌株均比根段直接培養法分離出來的菌株多。造成數量的差異主要是因為，研磨相當于把細菌根分成很小的根段，或者說通過研磨能把在菌根內纏在一起的菌絲最大程度地分離開，使菌絲盡可能形成獨立的菌株，避免覆蓋，而剪成一定長度的根段，由于不同種類的內生菌之間存在競爭關系，相互之間容易覆蓋，一般一個小根段只能分離出一株內生真菌，數量是有限的，所以研磨處理分離的菌株數量多；同樣的原因，造成種類的差異，研磨能把各個種類的真菌分離開，減少不同真菌之間的競爭，使得長勢慢的真菌與長勢快的真菌各自分離，所以研磨得到的種類多。根段組織研磨分離法為分離更多的菌種資源提供了切實可行的方法。

3.3 菌株的鑒定

分離到的175株內生真菌，根據其形態差異共分為12類，其中150株經形態學和分子綜合鑒定為5屬8種，其中有3個種都為Phialocephala屬，有文獻指出，該屬是菌根中常見的內生真菌[13]，形態多樣。另外，還有25株真菌無法鑒定到屬，有可能代表新真菌。

參 考 文 獻：

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