地黃毛狀根的誘導及條件優化

劉連旺　張永清　祁建軍等

摘要：以發根農桿菌Accc10060菌株侵染地黃外植體，研究不同菌液濃度、不同侵染時間和不同共培養時間對地黃毛狀根誘導率的影響。結果表明，發根農桿菌Accc10060菌株可成功誘導出地黃毛狀根，PCR檢測發現發根農桿菌Ri 質粒rolC基因已整合到地黃基因組中并得到表達；單因素試驗結果顯示，在地黃毛狀根的誘導過程中，誘導的最佳菌液濃度為OD600=0.6，最佳侵染時間為10 min，最佳共培養時間為4 d。

關鍵詞：地黃；毛狀根；發根農桿菌；誘導率

中圖分類號：S567.23+9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0047-04

Abstract Agrobacterium rhizogenes Accc10060 was used to infect the explants of Rehmannia glutinosa， then the influences of different bacterial concentrations， infection times and different co-culture times on hairy root induction rate were researched. The results showed that the hairy roots of R. glutinosa could be induced by A. rhizogenes Accc10060， and PCR detection results indicated that the rolC gene in Ri plasmid of A. rhizogenes had integrated into the genome of R. glutinosa and been expressed. The results of single factor experiment showed that the best induction conditions of hairy roots were OD600 as 0.6， infecting for 10 minutes and co-culturing for 4 days.

Key words Rehmannia glutinosa Libosch； Hairy root； Agrobacterium rhizogenes； Induction rate

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）為玄參科多年生草本植物，以新鮮或干燥塊根入藥[1]，始載于《神農本草經》，味甘性寒，具有滋陰養血、清熱涼血、補腎生津止渴等功效[2]。地黃是我國常用的大宗中藥材，其有效成分梓醇具有瀉下、保肝、強心、利尿和降血脂等作用。生產中地黃主要采用營養繁殖，傳統的栽培模式存在連作障礙，致使其種質退化，主要表現為根莖變細，產量下降，質量變差，嚴重影響地黃的產量和品質[3]。近年來利用生物基因工程手段生產藥用植物成為一條可行途徑，利用發根農桿菌感染植株形成的毛狀根體系生長快、易于培養、遺傳穩定性強、合成次生代謝物質能力突出[4]，發展潛力巨大。據統計，目前國內外已對26科92種藥用植物進行了毛狀根的誘導研究，如丹參[5]、人參[6]、甘草[7]和石斛[8]等，但對地黃毛狀根的研究才剛剛起步。本試驗利用發根農桿菌Accc10060感染地黃外植體誘導其產生毛狀根，PCR技術鑒定毛狀根，在此基礎上研究不同因素對地黃毛狀根誘導率的影響，初步優化了毛狀根的誘導條件，以期為地黃毛狀根大量培養奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地黃植株為本實驗室自培育的85-5地黃無菌苗，發根農桿菌Accc10060由中國醫學科學院藥用植物研究所祁建軍老師提供。

rolC引物由上海生工生物技術有限公司合成，Premix PrimeSTAR HS購自TaKaRa公司，植物組織常規提取試劑盒購自Tiangen公司，質粒提取試劑盒E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit Ⅰ購自OMEGA公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養與活化 取低溫保存的Accc10060菌株，無菌條件下接種于固體培養基（YEB+100 mg/L Rif）上，28℃暗培養48 h。挑取單菌落于YEB液體培養基中，28℃，200 r/min振蕩培養，至菌液OD600為0.6左右。5 000 r/min離心10 min，收集菌體，并用等體積的MS液體培養基（無蔗糖）重懸，供侵染使用。

1.2.2 地黃毛狀根的誘導與繼代培養 挑選幼嫩、生長旺盛的地黃無菌苗葉片，將其剪成0.5 cm2的小塊，接種于無激素的MS培養基上預培養2～3 d。將上述預培養后的外植體浸于制備的菌液中， 28℃，120 r/min振蕩侵染10 min。侵染后用無菌濾紙吸干外植體表面多余菌液，轉入MS固體培養基上黑暗條件下共培養。3～4 d后將共培養后的外植體置于液體培養基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，120 r/min、15 min清洗2次，以洗去外植體表面殘留的農桿菌，轉入到除菌培養基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，于25℃恒溫培養箱中暗培養誘導發根，每7 d轉接1次，連續除菌4～5次，直至無菌斑出現。待地黃外植體產生的毛狀根長至2～3 cm時，挑選生長迅速、分化旺盛的根段轉接于無激素的1/2MS固體培養基上，進行毛狀根的繼代培養。

1.2.3 地黃毛狀根PCR檢測 取完全除菌后的毛狀根約1 g，用常規植物組織DNA提取試劑盒提取毛狀根DNA，借助質粒提取試劑盒從5 mL過夜培養的菌液中提取質粒DNA，作為陽性對照，同時以非轉化根的DNA作為陰性對照。根據文獻[9]，合成rolC上游引物：5′-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3′；下游引物： 5′-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3′。PCR反應體系25 μL，包括Premix PrimeSTAR HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 40 ng，ddH2O 10 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；98℃10 s，56℃ 退火15 s，72℃延伸 1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外成像系統下觀察DNA條帶并拍照。endprint

1.2.4 不同因素對地黃毛狀根誘導率的影響 通過單因素試驗，研究不同因素對地黃毛狀根誘導率的影響，以篩選最佳的誘導條件。

菌液濃度的篩選：將菌液濃度OD600設為0.2、0.4、0.6、0.8，侵染時間為10 min，共培養時間為4 d。

侵染時間的篩選：將侵染時間設為0、5、10、15、20 min，菌液濃度OD600為0.6，共培養時間為4 d。

共培養時間的篩選：將共培養時間設為0、2、4、6 d，菌液濃度OD600為0.6，侵染時間為10 min。

10 d后統計毛狀根誘導率，計算公式如下：

誘導率（%）=產生毛狀根的外植體總數/接種的外植體總數×100。

2 結果與分析

2.1 地黃毛狀根的誘導和培養

發根農桿菌Accc10060侵染后的地黃葉片可成功誘導出毛狀根。外植體經除菌培養10 d后，出現生根現象，每個葉片基部一般可誘導出一條或幾條毛狀根。經繼代除菌培養后的毛狀根，接種于無激素的1/2MS培養基數天后，生長加快產生許多側根，生長狀況良好。

2.2 地黃毛狀根的鑒定

以地黃毛狀根的基因組DNA為模板，利用rolC基因的上下游引物進行PCR擴增檢測。結果顯示，從轉化的地黃毛狀根總DNA中擴增出特異性片段，該片段與Accc10060質粒DNA的擴增結果一致，而從未轉化的地黃根中則未擴增出此片段（見圖1），說明含有rolC基因的發根農桿菌Ri 質粒T-DNA部分片段已整合到地黃基因組中，并獲得表達。

2.3 不同因素對地黃毛狀根誘導率的影響

2.3.1 不同濃度菌液對地黃毛狀根誘導率的影響 菌液濃度直接影響著農桿菌侵染效率，在一定范圍內，菌液濃度越高，菌體在植物細胞上的附著率越高，越有利于毛狀根的轉化，但濃度過高會增加對外植體的傷害，導致其褐化死亡，轉化效果不佳。由表1可知，當菌液濃度為OD600=0.6左右時，地黃毛狀根誘導率達最高，菌液濃度過低或過高均不利于其誘導。

2.3.2 不同侵染時間對地黃毛狀根誘導率的影響 適宜的侵染時間有助于發根農桿菌對寄主植物的附著和轉化，從而提高誘導率。侵染時間過短，農桿菌不能對植物細胞進行充分附著；侵染時間過長，發根農桿菌易對外植體細胞造成傷害，且不利于后期的除菌培養。由表2可知，侵染10 min時地黃毛狀根的誘導效果最佳，之后隨著侵染時間的增加，誘導率逐漸下降。侵染時間為20 min時，后期除菌培養困難，外植體逐漸褐化，直至最終死亡。

2.3.3 共培養時間對地黃毛狀根誘導率的影響 共培養時間通常是發根農桿菌將T-DNA轉移到植物細胞內的時間，適當的共培養時間是農桿菌成功轉化的關鍵。由表3可知，共培養時間在0～4 d 時，隨著共培養時間的延長，地黃毛狀根的誘導率逐漸升高；當共培養時間為6 d時，誘導率為0，菌株大量增殖，幾乎覆蓋了外植體的表面，外植體褐化程度較高，不利于毛狀根的誘導。

3 結論與討論

本研究利用發根農桿菌Accc10060菌株侵染地黃的葉片，可成功誘導出毛狀根，且大多數毛狀根的發根部位集中在形態學下端的葉脈切口表面，這與丹參[10]、何首烏[11]的毛狀根誘導結果一致，分析可能與生長激素的極性運輸與分布有關。結合PCR 檢測技術，從地黃毛狀根基因組中擴增出與rolC基因一致的特異性條帶，表明發根農桿菌 Ri質粒的T-DNA已整合到地黃基因組中。

同時，通過對菌液濃度、侵染時間和共培養時間3個影響因素的試驗，優化了地黃毛狀根的誘導條件。李景濱等[12]研究發現，菌液OD600在0.8左右時，金鐵鎖毛狀根的誘導效果最佳，本試驗結果表明，地黃毛狀根誘導的最佳侵染菌液濃度為OD600=0.6，說明不同植物對發根農桿菌的敏感性有所差異，選擇合適的菌液濃度有助于提高轉化率。農桿菌對外植體的侵染時間是遺傳轉化中的重要因素，侵染時間的長短與誘導率的高低有著直接關系。孫晶等[13]研究表明，北柴胡毛狀根誘導的最佳侵染時間為20 min，本試驗中適于地黃毛狀根誘導的最佳侵染時間為10 min，兩試驗均表明，隨著侵染時間的延長，后續除菌困難， 外植體褐化嚴重，不利于毛狀根的誘導。共培養時間的長短與轉化效率密切相關。共培養時間過短則不能完成T-DNA的轉移與整合，導致轉化效率很低；共培養時間過長，農桿菌的過度增殖會毒害外植體，導致植物材料的壞死，也不利于毛狀根的誘導。楊蕊等[14]研究發現，共培養3 d時，杜仲毛狀根誘導率最高，為73%，當共培養時間增長至 5 d時，誘導率明顯下降。本研究表明，適于地黃毛狀根誘導的最佳共培養時間為4 d。

此外，在毛狀根誘導過程中發現，適當添加外源激素和乙酰丁香酮，有助于毛狀根誘導率的提高。郭生虎等[15]研究發現，添加100 μmol/L乙酰丁香酮較未添加的對照組毛狀根誘導率明顯提高。周倩耘等[16]認為適宜濃度的IAA、IBA、NAA、2，4-D，均可不同程度地促進人參毛狀根的生長以及皂甙的積累。

本研究初步建立了地黃毛狀根的誘導培養體系，但由于發根農桿菌轉化植物產生毛狀根的過程較為復雜，影響因素眾多，因此，更為詳細的誘導條件有待進一步篩選優化。

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