小麥黃花葉病毒衣殼蛋白的原核表達及抗血清制備

唐偉　程德杰　魏嬌等

摘要：通過RT-PCR方法擴增獲得小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）的衣殼蛋白（CP）基因，將其連接原核表達載體pEHISTEV，并將重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta，經IPTG誘導后，可以表達38 kD的融合蛋白。通過切膠回收的方法收集目的蛋白，免疫新西蘭長耳兔，制備WYMV CP的多克隆抗體。間接ELISA測定該抗血清效價為1∶2 048，Western blotting分析表明該血清可以與病株中CP發生特異性反應，而與健康植株汁液無反應。該血清為WYMV的檢測及CP功能的研究奠定了基礎。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；外殼蛋白；原核表達；抗血清；檢測

中圖分類號：S512.1：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0088-04

Abstract The coat protein （CP） gene of wheat yellow mosaic virus （WYMV） was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-WYMVCP. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a 38 kD fusion protein after inducing by IPTG. The fusion protein was collected as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against WYMV CP. Finally the polyclonal antiserum was obtained with titer above 1∶2 048 by ELISA. With this antiserum， the WYMV CP in the infected wheat plant could be detected specifically by Western blotting. The resultant antibody will facilitate the detection of WYMV and the functional studies of WYMV CP.

Key words Wheat yellow mosaic virus； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum； Detection

小麥黃花葉病是由馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus）的小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的[1]。自20世紀70年代中國報道小麥黃花葉病以來，在長江中下游、黃淮流域、四川盆地等小麥產區均有該病害的報道[2～8]。近年來，由于感病品種的大面積種植等原因，該病日趨嚴重，現全國發病面積達200×104 hm2， 每年減產在15×108 kg以上[9]。

WYMV為二分體正單鏈RNA病毒，病毒粒子彎曲線狀，有250～300 nm和550～700 nm兩種長度。WYMV以土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L.）為介體進行傳播，侵染小麥造成危害。病毒在秋后即可侵染小麥，但不顯癥；在小麥返青期，葉片上產生花葉或者梭條形病斑，植株矮化。當氣溫超過20℃時，病株隱癥。發病植株在成熟期表現為麥穗短小，籽粒不飽滿，產量下降[10，11]。

病毒的衣殼蛋白（Coat protein，CP）是具有多種功能的結構蛋白，在病毒生活史的各個階段中具有重要的功能[12，13]；此外，病毒的CP能夠和病毒其他蛋白進行互作共同行使某種功能，如癥狀表現[14，15]、病毒粒子裝配、病毒傳播[16，17]、復制[18]、RNA轉錄[19]、移動[13， 20]、抑制寄主的RNA沉默[21，22]以及激活R基因調節的寄主抗性[23]等。

本研究在對山東小麥黃花葉病毒分子檢測的基礎上，利用RT-PCR的方法，擴增獲得WYMV CP基因，構建了原核表達載體并在大腸桿菌中高效表達，通過免疫家兔制備了相應的特異性抗血清，為WYMV檢測以及WYMV CP基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta（DE3）及原核表達載體pEHISTEV均由本實驗室保存；Taq DNA聚合酶、pMD18-T、限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司； TransZol、反轉錄和PCR產物回收試劑盒、SDS-PAGE所用蛋白Marker購自TransGen公司；硝酸纖維素膜為Pall Gelman公司產品；堿性磷酸酯酶標記的鼠抗兔IgG、福氏不完全佐劑購自Sigma公司；Western blotting所用蛋白Marker購自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl等為國產分析純。

1.2 引物設計及WYMV CP基因的克隆

根據2012年叢倩倩獲得的WYMV CP基因序列[24]設計PCR引物。正向引物為WYMV-CP-NcoⅠ-F（5′-CTA GCC ATG GCA GCT GAC ACA C-3′），反向引物為WYMV-CP-SalⅠ-R（5′-GCG TCG ACT TAG GTT AGT TCT GG-3′）。endprint

以山東泰安采集的WYMV病株為材料，參照TransZol試劑盒說明，從新鮮病株提取總RNA。以提取的總RNA為模板， 在引物Oligo（dT）18引導下利用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，進行PCR。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，使用PCR凝膠回收試劑盒回收目的片段。連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌后篩選陽性克隆進行測序。

1.3 cp基因原核表達載體構建及表達

將獲得的目的片段經NcoⅠ和SalⅠ雙酶切后，與經過相同酶切處理的pEHISTEV進行連接，轉化大腸桿菌DH5α。將經PCR擴增和酶切鑒定為陽性的重組質粒（pEHISTEV-WYMVCP）轉化大腸桿菌Rosetta。挑取單斑接種到3 mL含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養基中，37℃活化過夜。取200 μL 培養過夜的菌液放入20 mL（1∶100）含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養基中，37℃、220 r/min振蕩培養至OD600值為0.4～0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導4～6 h，離心收集菌體。加適量TE緩沖液（pH 8.0）振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。SDS-PAGE電泳檢測表達情況。

1.4 抗血清制備、效價及特異性測定

從凝膠上直接回收表達的蛋白條帶[25]，用適量生理鹽水稀釋后，加入等體積的福氏不完全佐劑進行乳化，采用皮下注射法免疫新西蘭長耳兔。每隔1周注射1次，共5次。最后一次注射1周后采血，收集抗血清，分裝后-20℃貯存。利用ELISA測定抗血清的效價，Western blotting分析抗血清的特異性。

2 結果與分析

2.1 WYMV CP基因克隆及原核表達

通過RT-PCR從病株中擴增到一條特異的900 bp左右的DNA片段（圖1），與預期大小相符。克隆后測序發現其大小為882 bp，Blast結果表明該片段為WYMV cp基因。

將該基因酶切、連接到原核表達載體pEHISTEV的多克隆位點，獲得重組質粒pEHISTEV-WYMVCP，轉化大腸桿菌Rosetta。經IPTG誘導后取菌體進行SDS-PAGE電泳，發現在38 kD左右出現一條特異性蛋白條帶（圖2），與預期大小一致，說明外源蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達。利用BandScan5.0檢測蛋白的表達量，發現pEHISTEV-WYMVCP目的蛋白的相對表達量占菌體總蛋白的34.0%。

2.2 抗血清制備及特異性檢測

將切膠回收的蛋白條帶乳化后免疫家兔，注射5次后獲得WYMV CP抗血清。以WYMV侵染的小麥和健康小麥為材料，用獲得的抗體進行Western blotting檢測。結果顯示WYMV侵染的小麥樣品在38 kD處出現了特異性的條帶，而健康小麥樣品無特異性免疫反應（圖3），說明以原核表達的WYMV CP蛋白為抗原制備的抗血清能夠特異地與病株中WYMV CP蛋白結合。

2.3 抗血清的效價

以健康小麥樣品為陰性對照，以WYMV侵染的小麥樣品為材料，使用間接ELISA測定抗體效價。結果顯示，該抗體的效價可以達到1∶2 048（表1），表明該抗體效價相對較高。

3 結論與討論

病毒CP蛋白涉及病毒生活史的各個階段，在病毒粒子形成與病毒生物學中發揮作用

[12，13]。近年來的研究發現，WYMV的CP蛋白在其VPg蛋白核質穿梭過程中具有重要作用[26]。

在制備抗血清過程中，由于有些植物病毒在植株體內含量較低，不易獲得大量的抗原，提純的病毒粒子外殼蛋白容易在純化的過程中丟失，而且利用傳統的病毒提純方法無法完全去除寄主植物蛋白，制備的抗血清易產生假陽性。利用原核表達的方法可以在短時間內獲得大量目的蛋白，成為制備抗血清常用的方法。向榮[27]、楊狄[28]等利用原核表達方法獲得WYMV P1、P2蛋白，并成功獲得WYMV抗血清。韓成貴等利用pET-30a（+）載體表達了WYMV CP融合蛋白，其N-端包含55個載體氨基酸，制備的血清成功用于小麥黃花葉病的檢測[29，30]。

本研究利用了pEHISTEV原核表達載體，所表達的蛋白僅包含25個非病毒蛋白氨基酸。利用原核表達獲得的CP蛋白免疫家兔獲得了效價為1∶2 048的WYMV抗血清，該血清與病株中的WYMV CP有特異反應，而與健康植株無反應，說明制備的抗體有較高的效價和良好的特異性，可用于WYMV樣品的ELISA和Western blotting檢測。在Western blotting檢測病株葉片時，還出現了小于38 kD的條帶，這可能是由于寄主葉片細胞的衰老，導致病毒CP蛋白的水解。類似情況也在小麥條紋花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）CP蛋白的檢測中出現[31，32]。

抗血清的制備對檢測小麥黃花葉病的發生、明確小麥黃花葉病原以及預測預報具有積極作用，為深入研究CP功能奠定了基礎。

參 考 文 獻：

[1]雷娟利， 陳炯，陳劍平，等. 我國真菌傳線狀小麥花葉病毒病病原初步鑒定為小麥黃花葉病毒（WYMV）[J]. 中國病毒學，1998，13（1）：90-97.

[2]孫炳劍， 羊健， 孫麗英，等. 禾谷多黏菌傳小麥病毒病的分布及變化動態[J]. 麥類作物學報， 2011，31（5）：969-973.

[3]Han C， Li D， Xing Y，et al. Wheat yellow mosaic virus widely occurring in wheat （Triticum aestivum） in China[J]. Plant Disease，2000，84（6）：627-630.endprint

[4]阮義理， 鄒皖和， 王卉. 我國真菌傳大小麥病毒病的地理分布[J]. 植物保護學報， 1997，24（1）：35-38.

[5]李大偉， 韓成貴， 邢恰明， 等. 中國小麥黃花葉病毒（WYMV）分布的RT-PCR鑒定[J]. 植物病理學報， 1997，27（4）：303-307.

[6]Chen J. Occurrence of fungally transmitted wheat mosaic viruses in China[J]. Annals of Applied Biology， 1993，123（1）：55-61.

[7]羅瑞梧， 楊崇良. 山東小麥土傳花葉病的研究[J]. 山東農業科學， 1982（2）：6-12.

[8]王鳴岐， 劉國士， 陸秀海. 小麥梭斑花葉病毒病在我國發生的初步證實[J]. 四川農業科技，1980（1）：34-35.

[9]陳劍平. 中國禾谷多黏菌傳麥類病毒研究現狀與展望[J]. 自然科學進展， 2005，15（5）：524-533.

[10]林美琛， 阮義理. 小麥黃花葉?。╓YMV）的研究[J]. 植物病理學報，1986（2）：11-16.

[11]侯明生， 陳智鵬， 劉克儉. 小麥黃花葉病的初步研究[J]. 湖北農業科學， 1983（10）：25-27，41.

[12]Ivanov K I， Mkinen K. Coat proteins， host factors and plant viral replication[J]. Current Opinion in Virology， 2012，2（6）：712-718.

[13]Callaway A， Giesman-Cookmeyer D， Gillock E， et al. The multifunctional capsid proteins of plant RNA viruses[J]. Annual Review of Phytopathology， 2001，39（1）：419-460.

[14]Rao A， Grantham G L. Molecular studies on bromovirus capsid protein： II. Functional analysis of the amino-terminal arginine-rich motif and its role in encapsidation， movement， and pathology[J]. Virology，1996，226（2）：294-305.

[15]Dawson W O. Tobamovirus-plant interactions[J]. Virology，1992，186（2）：359-367.

[16]Blanc S， López-Moya J J， Wang R，et al. A specific interaction between coat protein and helper component correlates with aphid transmission of a potyvirus[J]. Virology， 1997，231（1）：141-147.

[17]Atreya C， Raccah B， Pirone T. A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus[J]. Virology， 1990，178（1）：161-165.

[18]Bol J F. Replication of alfamo-and ilarviruses： role of the coat protein[J]. Annual Review of Phytopathology， 2005，43：39-62.

[19]Dreher T W， Miller W A. Translational control in positive strand RNA plant viruses[J]. Virology， 2006，344（1）：185-197.

[20]Carrington J C， Kasschau K D， Mahajan S K，et al. Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants[J]. The Plant Cell， 1996，8（10）：1669-1681.

[21]Wang M B， Metzlaff M. RNA silencing and antiviral defense in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005，8（2）：216-222.

[22]Qu F， Ren T， Morris T J. The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step[J]. Journal of Virology， 2003，77（1）：511-522.

[23]Soosaar J L， Burch-Smith T M， Dinesh-Kumar S P. Mechanisms of plant resistance to viruses[J]. Nature Reviews Microbiology， 2005，3（10）：789-798.endprint