貴州省豬源沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子與耐藥基因盒研究

王源　譚艾娟　呂世明等

摘要： 為了調(diào)查規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)氏菌中Ⅰ類(lèi)整合子的流行情況，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)了從貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)分離的57株沙門(mén)氏菌中Ⅰ類(lèi)整合子的攜帶率以及整合子中耐藥基因盒的種類(lèi)；采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了57株沙門(mén)氏菌對(duì)12種抗菌藥物的敏感性；并應(yīng)用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株耐藥性的相關(guān)性。結(jié)果顯示，57株沙門(mén)氏菌中Ⅰ類(lèi)整合子檢出率為40.4%（23/57）；耐藥基因盒檢出率為31.6%（18/57）；整合子中攜帶可分別介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物耐藥的aadA2、aadA5、aadA22、aadA23b、dfrA1、dfrA12和dfrA17基因；57株沙門(mén)氏菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥率不同，Ⅰ類(lèi)整合子與多重耐藥之間有明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌；Ⅰ類(lèi)整合子； 基因盒； 耐藥性； 多重耐藥

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0105-04

Abstract To investigate the prevalence state of classⅠintegron in Salmonella， the carrying rates of classⅠintegrons and the types of drug resistance gene cassettes of 57 Salmonella strains isolated from scale swine farms were determined by polymerase chain reaction （PCR）. The susceptibility of the Salmonella strains to 12 antimicrobial was tested by the broth dilution method. The correlation of anti-microbial resistance between the positive and negative strains of classⅠintegron was analyzed by χ2 test. The results showed that the carrying rate of classⅠintegrons and drug resistance gene cassettes was 40.4% （23/57） and 31.6% （18/57） respectively. The genes of aadA2， aadA5， aadA22， aadA23b， dfrA1， dfrA12 and dfrA17 were checked out in classⅠintegrons， which mediated Salmonella resistance to aminoglycoside antibiotics and sulfa drug resistance respectively. Fifty seven strains of Salmonella had different drug resistance rates to 12 antimicrobial. The gene cassette carried in classⅠintegron presented obvious relativity to multi-drug-resistance （MDR）.

Key words Salmonella； Integron classⅠ； Gene cassette； Drug resistance； Multi-drug-resistance

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是危害人和動(dòng)物健康的重要致病菌之一，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)和食品安全[1]。抗菌藥物的廣泛使用，尤其是不規(guī)范使用，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重[2]。整合子是介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的主要機(jī)制之一[3]，整合子作為可移動(dòng)的基因元件，在整合酶的作用下，可通過(guò)位點(diǎn)特異的重組系統(tǒng)捕獲外源性的基因盒并使之表達(dá)；同時(shí)整合子可定位于質(zhì)粒上，或者自身作為轉(zhuǎn)座子的一部分參與轉(zhuǎn)移，使耐藥基因在細(xì)菌種間和種內(nèi)傳播[4]。整合子中絕大多數(shù)已知基因盒攜帶的是抗生素抗性基因，已確認(rèn)的有70多個(gè)抗性基因盒[5]。目前，對(duì)整合子的研究多集中在臨床菌株[6]，對(duì)豬源沙門(mén)氏菌的報(bào)道較少。本研究從貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)分離到57株沙門(mén)氏菌，對(duì)其Ⅰ類(lèi)整合子及攜帶的耐藥基因盒進(jìn)行了檢測(cè)，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析了Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株耐藥表型的相關(guān)性，對(duì)于監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性的傳播具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

緩沖蛋白胨水肉湯（BPW）、TTB肉湯、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鈉瓊脂（XLD）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、米勒-海頓肉湯（MHB）均購(gòu)自杭州博微生物技術(shù)有限公司；阿莫西林、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、復(fù)方新諾明、多粘菌素E、慶大霉素和磺胺甲基異惡唑原料藥購(gòu)自上海博微科技有限公司。Ex Taq酶試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物公司；質(zhì)粒小提試劑盒及T-A克隆試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

57株豬源沙門(mén)氏菌均分離于貴州各地區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)中，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC25922）購(gòu)自微生物保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板的制備 沙門(mén)氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑取單菌落采用煮沸法提取總DNA。

1.2.2 Ⅰ類(lèi)整合子檢測(cè) 根據(jù)Ⅰ類(lèi)整合子的整合酶基因序列，參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)引物（表1）。

50 μL PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。endprint

1.2.3 Ⅰ類(lèi)整合子基因盒檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)Ⅰ類(lèi)整合子基因盒可變區(qū)通用引物，上游：5′-GGCATCCAAGCAGCAAGC-3′，下游：5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′。50 μL PCR反應(yīng)條件如表3，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及序列分析 應(yīng)用天根生化科技有限公司膠回收試劑盒回收Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定，選取陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒，送上海生工生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。得到的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，確定Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)基因盒所含耐藥基因的種類(lèi)。

1.2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定57株沙門(mén)氏菌對(duì)12種抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）；并按中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥性統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子檢測(cè)結(jié)果

部分沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子intI1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。57株豬源性沙門(mén)氏菌中，共有23株得到303 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。陽(yáng)性菌株再經(jīng)Ⅰ類(lèi)整合子3′末端保守序列sul1基因檢測(cè)，23株菌株均擴(kuò)增出了大小為416 bp的目的條帶（圖2）。說(shuō)明23株豬源沙門(mén)氏菌均含有Ⅰ類(lèi)整合子，檢出率為40.4%（23/57）。

2.2 Ⅰ類(lèi)整合子耐藥基因盒檢測(cè)結(jié)果

單株沙門(mén)氏菌可擴(kuò)增出0～2個(gè)數(shù)目不等的條帶。其中，有3株沙門(mén)氏菌擴(kuò)增出2個(gè)大小不同的條帶，分別為1 kb與1.7 kb和1.7 kb與2.0 kb，攜帶率為13.04%（3/23）；有15株沙門(mén)氏菌擴(kuò)增出1個(gè)條帶，分別為1、1.2、1.7 kb和2.0 kb左右，攜帶率65.22%（15/23）；5株沙門(mén)氏菌沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明其Ⅰ類(lèi)整合子不含基因盒。

2.3 Ⅰ類(lèi)整合子耐藥基因盒序列分析

基因盒陽(yáng)性菌株質(zhì)粒提取物測(cè)序結(jié)果顯示，1 kb左右的條帶，含2種耐藥基因：aadA22和aadA23b，編碼氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶，與大觀霉素耐藥有關(guān)；1.2 kb大小的片段，包含一個(gè)耐藥基因dfrA1，編碼二氫葉酸合成酶，與甲氧芐啶耐藥有關(guān)；1.7 kb大小的片段，含有2個(gè)耐藥基因dfrA17和aadA5，編碼二氫葉酸合成酶和氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶，與甲氧芐啶和大觀霉素耐藥有關(guān)；2.0 kb大小的片段，含有dfrA12、aadA2和orfF，編碼二氫葉酸合成酶和氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶，與甲氧芐啶和大觀霉素耐藥有關(guān)，其中orfF為功能未知基因（表4）。

由表4可知，基因盒中所含耐藥基因以氨基糖苷類(lèi)耐藥基因出現(xiàn)頻率最高，為28.07%（16/57），沒(méi)有檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氯霉素類(lèi)、多肽類(lèi)藥物耐藥基因。

氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥基因以aadA5出現(xiàn)頻率最高，其次為aadA2、aadA22與aadA23b。磺胺類(lèi)藥物耐藥基因以dfrA17出現(xiàn)頻率最高，其次為dfrA12和dfrA1（表5）。

57株沙門(mén)氏菌對(duì)12種常用抗菌藥物存在不同程度的耐藥性，特別是對(duì)四環(huán)素類(lèi)的耐藥性最嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)100%；對(duì)多肽類(lèi)的耐藥率則相對(duì)較低，為22.8%。根據(jù)Ⅰ類(lèi)整合子檢測(cè)結(jié)果，將57株菌分為Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性菌組與陰性菌組，對(duì)12種抗菌藥物耐藥率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，頭孢噻呋鈉、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、慶大霉素、大觀霉素在整合子陽(yáng)性組的耐藥率極顯著或顯著高于整合子陰性組（P<0.01或P<0.05，表6）。

3 結(jié)論與討論

本研究從分離得到的57株沙門(mén)氏菌中檢測(cè)出23株攜帶有Ⅰ類(lèi)整合子，檢出率為40.4%（23/57），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，略低于國(guó)外報(bào)道的59%～75%[9]。其中18株含有耐藥基因盒，攜帶率為31.6%（18/57）。Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株耐藥譜明顯寬于陰性菌株，說(shuō)明Ⅰ類(lèi)整合子與細(xì)菌多重耐藥存在著密切關(guān)系[10～12]。

檢測(cè)出的耐藥基因盒均為Ⅰ類(lèi)整合子常見(jiàn)基因盒[13]。18株沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子基因盒陽(yáng)性株共含有7種不同的耐藥基因，其中，氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥基因檢出4種，與已有報(bào)道Ⅰ類(lèi)整合子攜帶aadA基因盒一致[14，15]，基因檢測(cè)結(jié)果與耐藥表型基本一致。

通過(guò)分析藥敏試驗(yàn)與基因檢測(cè)結(jié)果，得出所有Ⅰ類(lèi)整合子基因盒陽(yáng)性株均對(duì)磺胺異惡唑耐藥。復(fù)方新諾明中含有另外一種成分——甲氧芐啶，dfr基因編碼二氫葉酸合成酶，介導(dǎo)甲氧芐啶耐藥，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的菌株均檢測(cè)到dfr基因。因此，臨床用藥時(shí)需注意聯(lián)合用藥和輪換用藥并行。

本次檢出的沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子含有的耐藥基因盒可以解釋沙門(mén)氏菌分離株對(duì)氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物的耐藥性，但對(duì)于耐藥性較高的四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)卻未檢測(cè)出相應(yīng)的耐藥基因盒。因此，Ⅰ類(lèi)整合子攜帶的耐藥基因盒還不能完全解釋沙門(mén)氏菌所有的耐藥表型，可能存在著其他機(jī)制共同介導(dǎo)沙門(mén)氏菌耐藥表型，如其他類(lèi)整合子攜帶的耐藥基因盒、抗生素作用的靶位改變、細(xì)胞膜通透性改變、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)耐藥等。

整合子-基因盒系統(tǒng)在耐藥基因捕獲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。研究動(dòng)物源性細(xì)菌整合子-基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥機(jī)制是控制細(xì)菌耐藥性傳播的根源途徑。本試驗(yàn)從豬源沙門(mén)氏菌中檢測(cè)出了整合子及耐藥基因盒的存在，從分子水平分析細(xì)菌耐藥性獲得及傳播方式，為我國(guó)動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性傳遞研究積累基礎(chǔ)資料，為指導(dǎo)貴州省規(guī)模豬場(chǎng)合理選擇用藥、制定干預(yù)細(xì)菌多重耐藥的產(chǎn)生及傳播措施提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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