Ezrin和P53在結(jié)直腸癌中的表達及臨床病理意義

王昕煒，丁小英，樊祥山，惲 艷，劉元華

（1.江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，江蘇南京210009；2.中國藥科大學臨床藥學教研室，江蘇南京210009；3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇南京210008；4.武進區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，江蘇常州213159）

Ezrin和P53在結(jié)直腸癌中的表達及臨床病理意義

王昕煒1，丁小英2，樊祥山3，惲 艷4，劉元華1

（1.江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，江蘇南京210009；2.中國藥科大學臨床藥學教研室，江蘇南京210009；3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇南京210008；4.武進區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，江蘇常州213159）

目的 探討Ezrin和P53在結(jié)直腸癌中的表達及意義。方法 應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學技術(shù)檢測109例結(jié)直腸癌組織中Ezrin和P53蛋白表達，并應(yīng)用統(tǒng)計學方法分析Ezrin和P53表達水平與結(jié)直腸癌各種臨床病理特征的關(guān)系及二者相關(guān)性。結(jié)果 Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率[89.55%（60/67）]高于Ⅰ、Ⅱ期組[23.81%（10/42）]，低分化、未分化組表達陽性率[94.44%（17/18）]高于高分化、中分化組[58.24%（53/91）]，T3、T4組陽性率[67.31%（70/104）]高于T1、T2組[0（0/5）]，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率[89.55%（60/67）]高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組[23.81%（10/42）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其表達與性別、年齡無關(guān)。P53在結(jié)直腸癌中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率[53.73%（36/67）]高于Ⅰ、Ⅱ期組[23.81%（10/42）]，低分化、未分化組表達陽性率[72.22%（13/18）]高于高分化、中分化組[36.26%（33/91）]，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率[53.73%（36/67）]高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組[23.81%（10/42）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其表達與性別、年齡、浸潤深度無關(guān)。結(jié)直腸癌組織中Ezrin表達與P53無關(guān)（r=0.212，P＞0.05）。結(jié)論 應(yīng)用組織芯片大規(guī)模高效檢測臨床組織樣本是可行的，具有快速、方便、經(jīng)濟、準確等特點。Ezrin蛋白可能是預測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的有用指標；聯(lián)合檢測Ezrin、P53蛋白可作為判斷結(jié)直腸癌預后和篩選高危結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移患者的有效指標，有助于結(jié)直腸癌預后的判斷。

結(jié)直腸腫瘤； 基因，p53； 免疫組織化學； Ezrin； 組織芯片

結(jié)直腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率及死亡率高居前列，并呈明顯上升趨勢。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預后的重要因素。Ezrin基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，Ezrin蛋白參與了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。本研究對結(jié)直腸癌組織芯片應(yīng)用免疫組織化學（免疫組化）方法檢測Ezrin及P53蛋白表達，研究其與臨床病理特征（如癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期等）的關(guān)系，探討結(jié)直腸癌Ezrin蛋白表達與P53的關(guān)系，分析其在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，旨在為臨床診治和預后判斷提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 資料

1.1.1 標本收集 收集江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科及南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科2003～2007年存檔的結(jié)直腸癌標本109例。109例患者中男62例，女47例；年齡30～86歲，平均（61.53±11.79）歲，中位年齡62.0歲。

1．1.2 主要儀器與試劑 P53兔抗人單克隆抗體購自Zymed公司，Ezrin鼠抗人單克隆抗體購自Lab Vision/ Neomarkers公司，二抗（Envision兩步法鼠/兔通用型試劑盒K5007）購自DAKO公司，蜂蠟購自上海華靈公司，組織微列陣打孔儀購自美國Beecher instrument公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建組織芯片 對109例蘇木精-伊紅染色切片重新讀片，在蠟塊上圈定典型腫瘤病變部位。使用美國Beecher instrument公司組織微陣列打孔儀在蠟塊（空白）打孔，然后在結(jié)直腸癌病例蠟塊的圈定位置穿刺取得大小現(xiàn)狀與已打孔相同的蠟柱，再置入空白蠟塊的孔內(nèi)，即成組織芯片蠟塊。對組織芯片蠟塊進行連續(xù)切片40～60張，每張切片厚度4 μm，將制作的切片保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 P53、Ezrin測定 對組織芯片進行Envision兩步法免疫組化染色，實驗步驟按試劑盒說明書操作，每次試驗均設(shè)陽性對照和陰性對照。每項檢測指標均在另一張組織芯片上重復1次。由2名病理醫(yī)生采用雙盲法閱片判定免疫組化檢測結(jié)果。

1.2.3 免疫組化檢測結(jié)果判定 Ezrin蛋白陽性表達部位為細胞質(zhì)和（或）細胞膜，呈黃色顆粒。P53蛋白陽性表達部位為細胞核，呈黃色或黃褐色顆粒。根據(jù)腫瘤細胞染色強度進行評分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。按腫瘤細胞陽性百分比評分：＜5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～75%、＞75%分別計0、1、2、3、4分。最終染色結(jié)果為染色強度評分與陽性細胞百分比評分的乘積，總分最高為12分，最低為0分；0分計為陰性；1～3分記為弱陽性（1+）；4～7分記為陽性（2+），8～12分記為強陽性（3+）。將陰性、弱陽性視為陰性表達，陽性、強陽性視為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；Spearman秩相關(guān)分析采用Fisher′s檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ezrin、P53表達陽性率與臨床病理特征的關(guān)系Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期組，低分化、未分化組表達陽性率高于高分化、中分化組，T3、T4組表達陽性率高于T1、T2組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其表達與性別、年齡無關(guān)。P53在結(jié)直腸癌組織中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期組，低分化、未分化組表達陽性率高于高分化、中分化組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其表達與性別、年齡、浸潤深度無關(guān)，見表1。

2．2 Ezrin表達與P53的關(guān)系 70例Ezrin蛋白表達陽性患者中P53蛋白表達陽性35例，39例Ezrin蛋白表達陰性患者中P53蛋白表達陰性28例，Ezrin表達與P53無關(guān)（r=0.212，P＞0.05）。

表1 Ezrin、P53表達陽性率與臨床病理特征的關(guān)系（n=109）

3 討 論

組織芯片是在同一張載玻片上將數(shù)百或數(shù)十枚小圓柱形組織蠟塊樣本規(guī)整地排列而制成的微縮組織切片，組織芯片優(yōu)點：（1）體積?。唬?）樣本量大，一張芯片可包含數(shù)十至上百個樣本；（3）高通量，一次實驗即可獲得大量數(shù)據(jù)結(jié)果。該技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究。本研究制作的每張結(jié)直腸癌組織芯片上有104個樣品，僅用幾張芯片即完成研究，降低了工作強度及人力成本，大幅度節(jié)約了研究經(jīng)費，圓滿、快速地獲得了本研究所需的全部數(shù)據(jù)。因此，本研究再次證實了在大規(guī)模臨床組織樣本檢測中組織芯片簡便、高效，其與傳統(tǒng)病理切片比較，準確度不亞于傳統(tǒng)病理切片，具有高通量、便捷、費用低廉等特點。

腫瘤轉(zhuǎn)移包括多個步驟如細胞侵入基底膜、擴散到淋巴結(jié)或血管及在遠處生長等，在這些過程中腫瘤細胞發(fā)生形態(tài)改變，肌動蛋白細胞骨架作用在此過程中非常重要[1]。Ezrin是膜-細胞骨架連接蛋白，是ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）蛋白家族成員，其通過與膜蛋白（如E-鈣黏附蛋白/β-連環(huán)蛋白）與肌動蛋白細胞骨架連接，進而連接肌動蛋白細胞骨架與細胞膜，調(diào)節(jié)細胞與細胞間及細胞與基質(zhì)間的黏附，在細胞形態(tài)調(diào)節(jié)和細胞運動中發(fā)揮重要作用[2]。在惡性腫瘤中Ezrin通過與腫瘤細胞表面黏附分子發(fā)生作用調(diào)節(jié)腫瘤細胞特性，影響腫瘤的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。有研究表明，Ezrin在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用，在多種腫瘤中如骨肉瘤[4]、胰腺癌[5]、肝細胞癌[6]及舌鱗癌[7]等 Ezrin高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，與疾病預后呈負相關(guān)。Yu等[8]研究了乳腺癌組織中Ezrin表達與E-cadherin表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，Ezrin高表達且E-cadherin低表達組與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Ezrin高表達且E-cadherin低表達組Ezrin表達與E-cadherin表達呈負相關(guān)，Ezrin是乳腺癌的獨立預后因子。Ezrin促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用是通過下調(diào)E-cadherin表達實現(xiàn)的。乳腺癌細胞系高表達Ezrin促進腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。應(yīng)用小干擾RNA敲除Ezrin可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系的轉(zhuǎn)移[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期組，低分化、未分化組表達陽性率高于高分化、中分化組，T3、T4組表達陽性率高于T1、T2組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其表達與性別、年齡無關(guān)。與上述在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果一致，表明Ezrin高表達是結(jié)直腸癌發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)因素，Ezrin高表達可預示結(jié)直腸癌有較高的侵襲性和不良預后。

P53基因是人體抑癌基因之一。正常情況下野生型P53參與了細胞周期調(diào)控，是抑癌基因，對細胞增殖具有負調(diào)控作用，維持機體平衡狀態(tài)。在結(jié)直腸癌發(fā)生中P53基因也是最常發(fā)生突變的基因[11]，當P53基因發(fā)生突變時即失去抑癌作用，就會喪失對細胞分裂、增殖的負向調(diào)控作用，突變型P53基因不能抑制細胞增殖，使細胞惡性轉(zhuǎn)化能力和侵襲性增強，導致腫瘤的發(fā)生[12]。P53蛋白主要集中于核仁區(qū)。野生型P53由于半衰期短，在組織、細胞中含量極少，通過免疫組化方法檢測的是突變型P53蛋白表達情況，即表明P53基因發(fā)生了突變。P53過度表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)已得到證實，腫瘤組織中P53蛋白過度表達證明腫瘤有較強的侵襲力和轉(zhuǎn)移力，提示預后不佳。另外P53表達與放療敏感性顯著相關(guān)，其在調(diào)節(jié)腫瘤細胞放療反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，可作為放療敏感相關(guān)基因[13]。因此，檢測P53蛋白可作為判斷結(jié)直腸癌嚴重程度、預后及指導治療的一項重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，P53在結(jié)直腸癌中高表達，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期組表達陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期組，低分化、未分化組表達陽性率高于高分化、中分化組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其表達與性別、年齡、浸潤深度無關(guān)，T1、T2組只有5例患者，病例數(shù)太少可能是未檢出P53與浸潤深度相關(guān)的原因，但進一步證實了P53蛋白過度表達的結(jié)直腸癌有較強的侵襲力和轉(zhuǎn)移力，提示預后不佳。

有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌[14]及膀胱癌[15]中 Ezrin表達與P53無關(guān)。而結(jié)直腸癌中Ezrin表達與P53的關(guān)系仍不清楚，本研究探討了結(jié)直腸癌Ezrin表達與P53的相關(guān)性，結(jié)果顯示，Ezrin表達與P53無關(guān)，表明其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤過程中可能不存在相互影響，不具有協(xié)同作用。

總之，結(jié)直腸癌組織中Ezrin、P53表達上調(diào)，與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Ezrin、P53表達陽性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，腫瘤分化程度低，提示預后不良。聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌組織P53、Ezrin蛋白表達可幫助判斷腫瘤嚴重程度、有效評價預后并可指導術(shù)后治療。

[1]Friedl P，Wolf K.Tumour-cell invasion and migration：diversity and escape mechanisms[J].Nat Rev Cancer，2003，3（5）：362-374.

[2]Tsukita S，Yonemura S.ERM（ezrin/radixin/moesin）family：from cytoskeleton to signal transduction[J].Curr Opin Cell Biol，1997，9（1）：70-75.

[3]Wald FA，Oriolo AS，Mashukova A，et al.Atypical protein kinase C（iota）activates ezrin in the apical domain of intestinal epithelial cells[J].J Cell Sci，2008，121（Pt 5）：644-654.

[4]Khanna C，Wan X，Bose S，et al.The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis[J].Nat Med，2004，10（2）：182-186.

[5]Meng Y，Lu Z，Yu S，et al.Ezrin promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells[J].J Transl Med，2010，8：61.

[6]Kang YK，Hong SW，Lee H，et al.Prognostic implications of ezrin expression in human hepatocellular carcinoma[J].Mol Carcinog，2010，49（9）：798-804.

[7]Saito S，Yamamoto H，Mukaisho K，et al.Mechanisms underlying cancer progression caused by ezrin overexpression in tongue squamous celll carcinoma[J].PLoS One，2013，8（1）：e54881.

[8]Yu Z，Sun M，Jin F，et al.Combined expression of ezrin and E-cadherin is associated with lymph node metastasis and poor prognosis in breast cancer[J].Oncol Rep，2015，34（1）：165-174.

[9]Elliott BE，Meens JA，SenGupta SK，et al.The membrane cytoskeletal crosslinker ezrin is required for metastasis of breastcarcinoma cells[J].Breast Cancer Res，2005，7（3）：R365-373.

[10]Li Q，Wu M，Wang H，et al.Ezrin silencing by small hairpin RNA reverses metastatic behaviors of human breast cancer cells[J].Cancer Lett，2008，261（1）：55-63.

[11]Baker SJ，Preisinger AC，Jessup JM，et al.p53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis[J].Cancer Res，1990，50（23）：7717-7722.

[12]Wiman KG.Pharmacological reactivation of mutant p53：from protein

structure to the cancer patient[J].Oncogene，2010，29（30）：4245-4252.

[13]Komuro Y，Watanabe T，Hosoi Y，et al.Prediction of tumor radiosensitivity in rectal carcinoma based on p53 and Ku70 expression[J].J Exp Clin Cancer Res，2003，22（2）：223-228.

[14]Gschwantler-Kaulich D，Natter C，Steurer S，et al.Increase in ezrin expression from benign to malignant breast tumours[J].Cell Oncol（Dordr），2013，36（6）：485-491.

[15]Athanasopoulou A，Aroukatos P，Nakas D，et al.Decreased ezrin and paxillin expression in human urothelial bladder tumors correlate with tumor progression[J].Urol Oncol，2013，31（6）：836-842.

Expression and clinicopathologic significance of Ezrin and P53 in colorectal carcinoma

Wang Xinhui1，Ding Xiaoying2，F(xiàn)an Xiangshan3，Yun Yan4，Liu Yuanhua1
（1.Department of Internal Medicine，Jiangsu Provincial Tumor Hospital，Nanjing，Jiangsu 210009，China；2.Teaching and Researching Section of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 210009，China；3.Department of Pathology，Affiliated Gulou Hospital，Medical College of Nanjing University，Nanjing，Jiangsu 210008，China；4.WujinDistrictMaternalandChildHealthCareFamilyPlanningServiceCenter，Changzhou，Jiangsu213359，China）

ObjectiveTo study the expression levels of Ezrin and P53 in colorectal carcinoma and their clinicopathological significance.MethodsThe tissue microarray and immunohistochemical staining technology were used to detect the expression of Ezrin and P53 in 109 cases of colorectal carcinoma tissues.The correlation between Ezrin and P53 expressions and their relation with the clinicopathological characteristic of colorectal carcinoma were analyzed by using the statistical method.ResultsThe Ezrin protein was highly expressed in the colorectal carcinoma tissues，the positive expression rate in the TNM stageⅢ，Ⅳgroup was 89.55%（60/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the TNM stageⅠ，Ⅱgroup，the expression positive rate in the low differentiation and non-differentiation group was 94.44%（17/18），which was higher than 58.24%（53/91）in the high and middle differentiation group，the positive rate in the T3，T4 group was 67.31%（70/104），which was higher than 0 （0/5）in the T1，T2 group，the positive rate in the lymph node metastasis group was 89.55%（60/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the non-lymph node metastasis group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；its expression had no relation with the sex and age.P53 was highly expressed in the colorectal carcinoma tissues，the expression positive rate in the TNM stageⅢ，Ⅳgroup was 53.73%（36/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the TNMstageⅠ，Ⅱgroup，the positive rate in the low differentiation and non-differentiation group was 72.22%（13/18），which was higher than 36.26%（33/91）in the high and middle differentiation group，the positive rate in the lymph node metastasis group was 53.73%（36/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the non-lymph node metastasis group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；its expression had no relation with the sex，age and infiltration degree.The Ezrin expression in the colorectal carcinoma had no relation with P53（r=0.212，P＞0.05）.ConclusionApplying the tissue microarray for efficiently detecting clinical tissue samples in large scale is feasible and has the advantages of rapidness，convenience，economy and accuracy.The Ezrin protein may be a useful indicator for predicting the metastasis of colorectal carcinoma；the combined detection of Ezrin and P53 may serve as an effective indicator for judging the prognosis of colorectal carcinoma and screening the metastasis of colorectal carcinoma，which is conducive to the judgment of colorectal carcinoma prognosis.

Colorectal neoplasms； Genes，p53； Immunohistochemistry； Ezrin； Tissue microarrays

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.001

A

1009-5519（2015）24-3689-03

2015-09-25）

國家自然科學基金資助項目（81101815）。

王昕煒（1978-），男，江蘇無錫人，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科治療的研究；E-mail：wxwswy@163.com。

劉元華（E-mail：yuanhualiu02@hotmail.com）。