脂肪來源干細胞移植抑制腦缺血大鼠Neurocan的表達

陳愛珍，胡方進，林菲菲

（福建醫科大學附屬龍巖第一醫院血液內科，福建龍巖364000）

脂肪來源干細胞移植抑制腦缺血大鼠Neurocan的表達

陳愛珍，胡方進，林菲菲

（福建醫科大學附屬龍巖第一醫院血液內科，福建龍巖364000）

目的 探討脂肪來源干細胞（ADSC）移植對腦缺血大鼠神經蛋白聚糖（Neurocan）表達的影響。方法 選取清潔級成年雄性SD大鼠54只，隨機分為假手術組、模型組（大腦中動脈栓塞）和ADSC組（大腦中動脈栓塞后移植ADSC），每組18只。大腦中動脈栓塞模型采用改良Zea-Longa線栓制法，ADSC移植前用二脒基苯基吲哚標記，ADSC組于造模成功1 d后經側腦室注入ADSC（1×106cells）。分別于術后7、14、28 d將大鼠斷頭取腦，采用免疫熒光、蛋白質印跡檢測腦組織Neurocan蛋白表達情況。結果 術后第7、14天模型組大鼠腦組織Neurocan表達明顯升高，呈片狀不規則分布，至28 d下降，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）。術后7、14 d ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達明顯減少，并持續至28 d，與模型組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 ADSC移植后可減少腦缺血組織Neurocan表達，減少瘢痕產生，為后期神經軸突的成熟及功能建立提供了有利環境，可促進神經功能的恢復。

干細胞； 疾病模型，動物； 顱內栓塞和血栓形成； 蛋白聚糖類； 神經軸突

以往認為成年動物腦受損后神經元不易再生，自我修復能力有限，因此，如何促進腦損傷突觸再生是目前研究的焦點和難題。近年來，干細胞因具有多向分化潛能特性在中樞神經系統損傷治療中取得一定進展。前期研究發現，脂肪來源干細胞（adipose-derived stemcell，ADSC）移植對腦缺血大鼠神經功能恢復具有一定促進作用[1-3]，但具體機制仍不明確。目前認為，神經蛋白聚糖（Neurocan）是受損神經元再生的主要抑制因子，參與了膠質瘢痕的形成，抑制軸突生長。本研究主要通過研究ADSC移植對腦缺血組織Neurocan表達的影響，旨在為臨床治療提供新的干預靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 選取實驗動物清潔級成年SD雄性大鼠（體質量250～280 g）54只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。自來水喂養，自由進食普通顆粒型大鼠飼料，動物房溫度控制在22～25℃。二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）由 Sigma公司提供；兔抗大鼠CD44、CD34、CD106抗體由Santa Cruz公司提供；細胞培養瓶由Coming公司提供；Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L胰酶、胎牛血清、杜氏改良Eagle培養基/LG復合培養基由Gibco公司提供；小鼠抗大鼠單克隆Neurocan抗體（一抗）由Chemicon公司提供；山羊封閉血清、四甲基若丹明異硫氰酸鹽標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G-HRP（二抗）由北京中杉劍橋公司提供；小鼠抗大鼠β-actin抗體由武漢博士德公司提供；蛋白質印跡（Western blot）試劑由碧云天公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 ADSC分離、培養、鑒定及標記 參照文獻[3]進行ADSC分離、培養、鑒定及標記。

1.2.1.2 動物分組 將54只大鼠隨機分為假手術組、模型組（大腦中動脈栓塞）和ADSC組（大腦中動脈栓塞后移植ADSC），每組18只。每組均按術后7、14、28 d不同時間點分為3個亞組，每個亞組6只。

1.2.1.3 腦缺血動物模型及ADSC側腦室移植模型的建立 參考改良Zea-Longa線栓法制備大腦中動脈栓塞模型，假手術組術中只暴露大腦中動脈，不插線栓。ADSC組于造模成功后24 h通過腦立體定位儀經顱骨上鉆孔將側腦室套管在預定位置固定，用微量注射器注射DAPI標記的ADSC（1×106cells）細胞懸液，參照文獻[3]的方法操作。

1.2.1.4 腦組織標本的采集 將大鼠腹腔麻醉（10%水合氯醛）后暴露心臟，經左心室進行主動脈插管作為灌注液入口，以剪開的右心耳為流出口，用生理鹽水200 mL快速沖洗，取出全腦，在冰盤上迅速分離出右側大腦半球視交叉后6～11 mm腦組織，部分保存于-80℃冰箱用于Western blot檢測；部分在恒冷切片機中速凍，制作冠狀切片（10 μm），固定晾干后放入-20℃冰箱保存用于免疫熒光檢測。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 免疫熒光檢測 腦組織標本采用冰凍切片，室溫下復溫45～60 min，5 g/L Triton放置30 min，血清封閉1 h，滴加一抗（1∶200），4℃孵育過夜。第2天室溫放置1 h，滴加二抗（1∶200），避光1 h，每步驟均用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗，最后用甘油封片。重復上述方法，對照實驗用PBS代替一抗。放置熒光顯微鏡檢測。

1.2.2.2 Western blot檢測 取100 mg腦組織提取總蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，轉膜結束后用TBS清洗，封閉1 h（5%脫脂奶粉溶液），加一抗（1∶400），4℃孵育過夜，TBS清洗后加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。將膜進行發光液處理，在暗室進行膠片曝光顯影。采用ImageJ軟件以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值進行分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ADSC的形態及鑒定 第3代培養的細胞多呈均一長梭形，并高表達ADSC表面特異性標志物——CD44，而低表達CD106及CD34，見圖1。

圖1 ADSC的形態及鑒定

2.2 免疫熒光檢測結果 假手術組大鼠腦組織Neurocan少量表達，模型組大鼠腦組織Neurocan呈片狀不規則分布，見圖2。

2.3 Western blot檢測結果 術后7、14 d模型組大鼠腦組織Neurocan表達增多，于28 d下降，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；術后各時間點ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達均明顯下降，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 術后14 d各組大鼠腦組織Neurocan表達情況比較（免疫熒光，200×）

圖3 術后各時間點各組大鼠腦組織Neurocan表達情況比較（Western blot）

3 討 論

有研究表明，中樞神經系統損傷后因神經營養因子缺乏、炎性細胞因子破壞、抑制因子分泌等各種不利因素環境下受損神經元自我修復能力有限，即使神經元軸突再生，大部分也難與突觸后神經元建立新的功能性聯系，其中膠質瘢痕是其主要障礙，當神經細胞在軸突延伸和遷移過程中遇到膠質瘢痕屏障時就會被阻止繼續沿原方向運動，無法正常發育和導向，失去行使神經沖動和信號轉導功能[4]。Neurocan是中樞神經系統一種重要的硫酸軟骨素蛋白聚糖，主要參與早期腦組織發育過程中軸突生長、形成和成熟，到成年時幾乎不表達，但在成年動物腦損傷中被發現表達上調。有研究在腦損傷區周圍皮質中檢測到Neurocan在膠質瘢痕表達明顯增多，同時與增生的神經膠質纖維酸性蛋白陽性膠質細胞相互重疊，提示Neurocan是伴隨星形膠質細胞（astrocyte，AS）增生產生的調節因子，可能是神經修復的重要抑制分子，參與了膠質屏障的形成，阻礙神經軸突延長[5]。

近年來，干細胞因具有多向分化潛能特性，被用于治療中樞神經系統損傷的研究，目前，主要針對骨髓來源干細胞，已證實其在體外及腦缺血、脊髓損傷動物模型中均可減少抑制因子如Neurocan的表達，促進神經功能恢復[6-7]。Mahmood等[8]研究也顯示，骨髓來源干細胞在創傷性腦損傷中通過抑制AS、Neurocan表達，促進神經軸突生長。ADSC由于來源豐富，具有取材方便、移植免疫排斥反應小、多向分化等顯著優勢[9]也開始被國內外很多研究嘗試用于治療腦缺血疾病，對ADSC在腦缺血大鼠神經修復過程中可能的分子機制進一步探索研究取得一定進展。本研究觀察到術后第7、14天模型組大鼠腦組織Neurocan表達明顯升高，呈片狀不規則分布，至28 d下降，但仍高于假手術組。腦梗死后神經軸突生長主要經歷3個關鍵階段：第7天是軸突出芽的起始觸發階段；第14天是軸突的持續生長階段；第28天是軸突再生的發育成熟階段[10]。根據本研究結果作者推斷，在亞急性期腦梗死周圍區Neurocan表達時間與軸突出芽基本一致，說明膠質瘢痕對早期軸突出芽的觸發、再生、延伸及重建可能產生重要影響。雖然神經元具有一定的自我修復力及可塑性，在后期可能逐漸建立側支循環恢復部分血供或分泌了一些有利因子，在一定程度上減少了Neurocan的表達，使未受損神經元發生了一定軸突功能重建，但通過觀察大鼠恢復情況，這種自我修復能力很有限。可能由于早期軸突出芽起始觸發、維持階段明顯受限，至后期神經再生軸突成熟相對明顯減少。因此，在此過程中提供有利因素促進早期軸突出芽對神經功能恢復相當重要。術后7、14 d ADSC組大鼠腦組織Neurocan表達明顯減少，并持續至28 d，提示ADSC對Neurocan表達具有抑制作用，為早期軸突觸發及再生創造了良好微環境，為后期神經軸突的成熟及功能建立提供了有利環境，可促進神經功能恢復。

總之，本研究進一步證實了在腦缺血大鼠中生長抑制因子對神經突觸重塑的重要影響，同時也表明，ADSC能有效抑制不利因子的表達，改善微環境，提高神經修復能力，為臨床治療提供了理論基礎。

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[2]杜厚偉，劉楠，王杰華，等.脂肪來源的干細胞移植對腦缺血大鼠腦組織IL-10及TNF-α表達的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25（11）：998-1001.

[3]陳愛珍，劉楠，黃歡，等.脂肪來源的干細胞移植對腦缺血大鼠神經軸突再生的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2011，27（8）：868-871.

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[5]Asher RA，Morgenstern DA，Fidler PS，et al.Neurocan is upregulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes[J].J Neurosci，2000，20（7）：2427-2438.

[6]Mahmood A，Wu H，Qu C，et al.Effects of treating traumatic brain injury with collagen scaffolds and human bone marrow stromal cells on sprouting of corticospinal tract axons into the denervated side of the spinal cord[J].J Neurosurg，2013，118（2）：381-389.

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Adipose-derived stem cell transplantation for inhibiting Neurocan expression in rat with cerebral ischemia

Chen Aizhen，Hu Fangjin，Lin Feifei
（Department of Hematology，Affiliated Longyan First Hospital，Fujian Medical University，Longyan，Fujian 364000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of adipose-derived stem cell（ADSC）on the Neurocan expression in rat with cerebral ischemia.Methods54 clean class adult male Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into the sham operation group，model group（middle cerebral arterial embolism）and ADSC group（ADSC transplantation after middle cerebral arterial embolism），18 cases in each group.The middle cerebral arterial embolism model adopted the modified Zea-Longa line embolism method.Before ADSC transplantation，diamidino-2-phenylindole（DAPI）labeling was performed.The ADSC group was injected with ADSC（1×106cells）by lateral ventricle on 1 d after successful model establishment.Rats were sacrificed for taking the brain on postoperative 7，14，28 d and the Neurocan protein expression was detected by using the immunofluorescence and Western blot.ResultsThe Neurocan expression of the brain tissues on postoperative 7，14 d in the model group was significantly increased and showed the sheet irregular distribution，which was decreased on 28 d，but still higher than that in the sham operation group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The Neurocan expression of the brain tissues on postoperative 7，14 d in the ADSC group was significantly decreased，moreover which continued to 28 d and showed the statistical difference compared withthe modelgroup（P<0.05）.ConclusionThe ADSCtransplantation can decrease the Neurocan expression in the brain ischemic tissues and reduce the scar generation，which provides the enabling environment for late nerve axons maturity and function establishment，and can promote the restoration of neural function.

Stemcells； Diseasemodels，animal； Intracranialembolismandthrombosis； Proteoglycans； Neuronalaxon

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.010

A

1009-5519（2015）24-3714-03

2015-09-24）

陳愛珍（1983-），女，福建漳平人，主要從事血液內科臨床工作；E-mail：chenaizhen2003@163.com。