瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表達

何影影，羅學剛，倪 萌，馬德云，王重喜，張同存

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表達

何影影，羅學剛，倪 萌，馬德云，王重喜，張同存

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

為建立溶栓藥物瑞替普酶（rPA）的乳酸菌表達系統，從實驗室前期構建的大腸桿菌表達質粒pET22b-rpa上擴增出目的基因rpa，將該基因與乳酸菌表達質粒pCYT連接，構建了pCYT-rpa質粒.此外，為提高rPA在乳酸乳球菌NZ9000中的穩定性，同時構建了rpa位于葡萄球菌（Staphylococcal）耐熱核酸酶基因nuc下游融合表達的重組質粒pCYT-nuc-rpa.將質粒pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa分別電轉化至乳酸乳球菌NZ9000中，經Nisin誘導表達，Western blot結果顯示Nuc可提高rPA在乳酸乳球菌中的穩定性，從而增加了rPA在乳酸菌中的表達量.重組rPA及Nuc-rPA在復性后均具有溶栓活性，活性分別為800，U/L和1，000，U/L.

瑞替普酶（rPA）；Nuc；乳酸乳球菌；表達

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是公認對人體安全的（generally regard as safe，GRAS）食品級微生物.利用乳酸菌表達系統重組表達蛋白質多肽類藥物可以有效提高產品的安全性，并可以一定程度上簡化后期純化工藝.為建立rPA的乳酸菌表達系統，本研究將rpa基因亞克隆至乳酸菌表達質粒pCYT.同時，為了提高rPA在乳酸菌NZ9000中的穩定性，將rPA與葡萄球菌（Staphylococcal）耐熱核酸酶（nuclease，Nuc）進行了融合表達，為rPA的基因工程生產提供了新的思路與研究基礎.

1 材料與方法

1.1 菌株及質粒

Escherichia coli DH5α由本實驗室保存，質粒pET22b-rpa為本實驗室前期構建［6-7］，乳酸菌表達質粒pCYT（含nuc標簽）及宿主菌株Lactococcus lactis NZ9000由本實驗室保存.

1.2 培養基與培養方法

LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10，g、酵母提取物5，g、NaCl 10，g，加入800，mL去離子水溶解，調pH至7.4，定容至1，L.121，℃高壓蒸汽滅菌20，min.

GM17液體培養基：稱取M17培養基42.3，g、葡萄糖5，g，加入800，mL去離子水溶解，調pH至7.4，定容至1，L.115，℃高壓蒸汽滅菌20，min.

恢復培養基：稱取M17培養基42.3，g、葡萄糖5，g、MgCl24.07，g、CaCl20.22，g，加入800，mL去離子水溶解，調pH至7.4，定容至1，L.115，℃高壓蒸汽滅菌20，min.

Escherichia coli DH5α，用LB液體培養基，37，℃、200，r/min振蕩培養；Lactococcus lactis NZ9000用GM17液體培養基，30，℃靜置培養.

氯霉素的使用質量濃度為10，μg/mL.

1.3 試劑與儀器

限制性內切酶NsiⅠ、HindⅢ、SalⅠ、T4，DNA連接酶、RNase-Free DNaseI，Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、DNA回收試劑盒，康為試劑公司；EasyTaq DNA聚合酶，全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒，索來寶公司；Nisin，Sigma公司；M17培養基，青島海博公司；RNA提取試劑盒，Invitrogen公司；RNA酶抑制劑，上海生工生物工程有限公司；tPA抗體，abcam公司；rPA標準品，中國食品藥品檢定研究院；實驗所用其他試劑為市售國產分析純試劑.

紫外可見光分光光度計，Thermo公司；電擊轉化儀、蛋白質電泳裝置，BioRad公司.

1.4 乳酸菌表達質粒的構建

以實驗室前期構建的大腸桿菌表達質粒pET22b-rpa為模板，根據rpa基因序列和pCYT上多克隆位點設計引物，引物信息見表1.

表1 PCR引物信息Tab. 1 Primers used in this research

以質粒p22b-rpa為模板，進行PCR擴增rpa基因.其中pCYT-rpa的構建以P1、P2（下劃線分別為：NsiⅠ和HindⅢ酶切位點）為引物，PCR反應條件為：94，℃預變性5，min，94，℃變性45，s，60，℃退火45，s，72，℃延伸2，min，共循環30次，72，℃延伸10，min.將 PCR產物與表達載體pCYT分別用限制性內切酶NsiⅠ和HindⅢ雙酶切后（pCYT上原有的nuc標簽將被切除），通過瓊脂糖膠電泳純化，經T4連接酶16，℃連接.pCYT-nuc-rpa的構建以P3、P4（下劃線分別為：HindⅢ和SalⅠ酶切位點）為引物，PCR反應條件與上述條件相同，擴增獲得目的基因rpa.將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，涂布于含10，μg/mL氯霉素的LB平板，37，℃培養12，h.次日挑取單菌落增菌，提取質粒進行雙酶切后電泳鑒定，送至Invitrogen公司測序.

1.5 rPA的誘導表達

將測序正確的重組質粒pCYT-rpa和pCYT-nucrpa（圖1）電轉化表達菌株乳酸乳球菌NZ9000的感受態細胞，電轉化條件為：電壓2，000，V、電容25，μF、電阻200，?，電擊后迅速加入1，mL恢復培養基，30，℃恢復培養2，h，涂布于含10，μg/mL氯霉素的GM17固體平板，30，℃厭氧培養48，h.挑取單菌落，進行PCR驗證.將含有目的基因的重組菌30，℃厭氧過夜培養，第2天以4%的接種量轉接于10，mL GM17液體培養基中，30，℃靜置培養至A600=0.4時，加入誘導劑Nisin至終質量濃度為10，μg/L，30，℃誘導2，h.

圖1 重組質粒pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa的結構示意圖Fig. 1 Schematic representation of recombinant plasmids pCYT-rpa and pCYT-nuc-rpa

1.6 RT-PCR分析rpa基因的表達

1.6.1 乳酸菌總RNA的提取

離心收集3，mL誘導后的菌體，用滅過菌的TE緩沖液洗滌3次，最后用200，μL TE緩沖液吹懸菌體，加入終質量濃度為20，mg/mL的溶菌酶，37，℃水浴30，min.每管加入0.5，mL Trizol，室溫放置10，min，使其充分裂解，然后輕輕吹勻.每管加入100，μL冰冷的氯仿，手動顛倒2，min，室溫放置5，min.4，℃、13，000，r/min離心15，min.吸取上層水相至另一個EP管中.每管加入250，μL冰冷的異丙醇，上下晃動2，min，冰上放置10，min，-20，℃放置1，h，沉淀RNA.4，℃、13，000，r/min離心10，min.RNA沉于EP管底部，輕輕棄去上清液.加入500，μL體積分數為75%的冰冷乙醇，劇烈振蕩EP管以懸浮沉淀，4，℃、13，000，r/min離心10，min.輕輕棄去上清液，打開EP管，室溫放置10，min，使殘余的乙醇揮發.每管加入20，μL DEPC處理過的水溶解RNA樣品，60，℃放置10，min.將提取的RNA經紫外可見分光光度計測定濃度后，加入RNase-Free DNaseⅠ于37，℃消化30，min后，利用隨機六聚體引物，經M-MLV逆轉錄酶反轉錄為cDNA.

1.6.2 RT-PCR檢測rpa基因

依據rpa基因序列設計擴增引物rpa-RT F和rpa-RT R；以L. lactis NZ9000的16S rRNA作為RTPCR反應的內參基因，上游和下游引物分別為16S F和16S R（表1）.RT-PCR反應體系為：EasyTaq buffer（10×）2.5，μL，dNTP 1.0，μL，上游和下游引物（10，μmol/L）各0.25，μL，cDNA模板1.0，μL，EasyTaq DNA聚合酶（5，U/μL）0.25，μL，Nuclease-Free water 19.25，μL，總計25.0，μL.優化后的PCR反應條件為：94，℃預變性5，min，94，℃變性45，s，56，℃退火45，s，72，℃延伸20，s，30個循環，72，℃延伸10，min.所有待測樣品均設3個重復，并用Nuclease-Free water代替模板作為陰性對照，以乳酸菌NZ9000的16S rRNA作為RT-PCR的內參基因.

1.7 Western blot鑒定表達產物

離心收集5，mL誘導后的菌體，用PBS洗滌3次，最后用1，mL PBS重懸菌體，然后進行超聲破碎.取等量超聲破碎液進行SDS-PAGE分析.SDSPAGE結束后，將凝膠中的蛋白經半干轉轉印至NC膜上；轉印結束后將NC膜浸于質量分數5%的脫脂乳溶液中進行封閉，室溫靜置封閉1，h；TBST洗去脫脂乳，用tPA兔源單克隆抗體作為第一抗體進行封閉（一抗稀釋比例為1∶800），4，℃過夜放置；TBST洗3次，每次10，min；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG作為第二抗體（二抗稀釋比例為1∶5，000），避光封閉1，h，TBST洗3次，每次10，min.利用OdysseyTM近紅外雙色激光成像系統顯色檢測.同時用Quantity one軟件對Western blot條帶的光密度進行分析，并與rPA誘導1，h參比，進行相對定量.

1.8 包涵體復性及活性測定

將菌體破碎液離心后取沉淀，經洗滌液（3，mol/L尿素，體積分數0.6%的TritonX-100，50，mmol/L Tris-HCl，2，mmol/L EDTA，pH 8.0）于搖床4，℃洗滌1，h，10，000，r/min離心20，min，取沉淀.然后用變性液（8，mol/L尿素，100，mmol/L GSH，50，mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）吹懸，于100，r/min搖床，25，℃變性2，h，10，000，r/min離心20，min取上清液.向上清液中加入等體積的50，mmol/L Tris-HCl將尿素濃度稀釋至4，mol/L，然后加到透析袋中，于復性液（50，mmol/L Tris-HCl，20，mmol/L咪唑，300，mmol/L NaCl，2，mol/L尿素，3，mmol/L GSH，0.6，mmol/L GSSG，pH 8.0）中4，℃過夜進行透析復性.最后，采用目前使用最廣泛的纖溶活性篩選方法——纖維蛋白平板法對樣品的溶栓活性進行分析.取100，μL復性后的rPA及NucrPA蛋白樣品，分別點加于纖維蛋白板上，37，℃放置12，h進行溶栓活性分析［8-9］.

2 結 果

2.1 rPA乳酸菌表達載體的構建及鑒定

pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa陽性克隆子經擴大培養、提取質粒后，用相應的限制性內切酶對質粒進行酶切鑒定，酶切結果均可看到大小約1，100，bp的片段（圖2和圖3），與預期片段大小一致，進一步通過序列測定，確認了目的基因rpa正確克隆到pCYT表達載體中，并具有正確的讀碼框.

圖2 重組質粒pCYT-rpa酶切鑒定圖Fig. 2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pCYT-rpa

圖3 重組質粒pCYT-nuc-rpa酶切鑒定圖Fig. 3Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pCYT-nuc-rpa

2.2 rpa在重組L. lactis NZ9000中的轉錄水平分析

將提取的乳酸菌RNA逆轉錄成的cDNA進行RT-PCR，結果如圖4所示.由圖4可知：與L. lactis NZ9000/pCYT相比，rpa重組菌L. lactis NZ9000/ pCYT-rpa和L. lactis NZ9000/pCYT-nuc-rpa中可檢測到rpa mRNA，表明外源基因rpa在兩種重組菌中能夠有效被轉錄.

圖4 乳酸菌L. lactis NZ9000中rpa轉錄的RT-PCR分析Fig. 4 RT-PCR analysis of rpa transcription in L. lactis NZ9000

2.3 rPA在重組L. lactis NZ9000中的表達水平分析

將提取的乳酸菌菌體蛋白進行Western blot及Quantity one半定量分析，結果如圖5所示.由圖5可知：目的蛋白rPA和Nuc-rPA在兩種重組乳酸乳球菌中均得到了有效的表達，相對分子質量分別為3.9×104和5.3×104，與預測的蛋白相對分子質量一致.對比兩種菌株在誘導1，h和誘導2，h時的蛋白表達量可知：在L. lactis NZ9000/pCYT-rpa菌株中，目的蛋白rPA在誘導2，h時比誘導1，h時表達量減少；而融合了Nuc的菌株L. lactis NZ9000/pCYT-nucrpa，誘導2，h時的目的蛋白Nuc-rPA與1，h的相比表達量增加，說明融合表達Nuc可降低胞內酶對rPA的降解，提高了rPA的穩定性.

圖5 乳酸菌L. lactis NZ9000中rPA和Nuc-rPA表達的分析Fig. 5 Analysis of rPA and Nuc-rPA expression in L. lactis NZ9000

2.4 乳酸菌表達rPA及Nuc-rPA的溶栓活性分析

將復性后的rPA和Nuc-rPA點加于纖維蛋白板中進行活性分析，結果如圖6所示.由圖6可知：除rPA標準品外，重組rPA及Nuc-rPA在復性后均具有溶栓活性，活性分別為800，U/L和1，000，U/L.而pCYT空質粒轉化菌表達產物則沒有溶栓活性.

圖6 乳酸菌L. lactis NZ9000 中rPA和Nuc-rPA表達活性分析Fig. 6 Activities of rPA and Nuc-rPA in L. lactis NZ9000

3 討 論

乳酸菌作為基因工程表達菌株具有無內毒素、安全性好、遺傳背景清楚、表達效率高、分泌特性好等優點［10-11］.隨著對其分子生物學研究的迅速發展，一系列乳酸菌基因表達載體和受體系統逐步建立. Nisin誘導的基因表達系統（Nisin controlled gene expression system，NICE）是目前最為成功且應用最廣的乳酸菌表達系統［12］.NICE系統是利用nisinA啟動子和nisK、nisR基因構建的一系列表達載體和相應的宿主菌，1996年起開始用于目的基因的表達研究.其中，nisinA可以誘導其自身啟動子進行轉錄，誘導效率在1，000倍以上，而調節因子nisK和nisR則是誘導過程中信號傳導所必需的.此外，報道顯示，乳酸菌NICE系統重組蛋白的合成可以達到很高的水平，能達到總胞內蛋白的60%.由于Nisin誘導表達系統的誘導物和宿主菌都是食品級的，因此利用該系統表達具有臨床應用價值的多肽或蛋白，可提高產品安全性，并簡化表達產物的后處理工藝［13］.國外研究已成功在乳酸乳球菌中表達了葡萄糖苷酶、脂肪酶等多種生物活性酶［14-15］.

在乳酸菌異源蛋白的表達研究方面，人們已開發了多種表達目的蛋白的基因工具，其中葡萄球菌耐熱Nuc由于很方便于生化分析，可作為一個報告蛋白監測蛋白質靶定和構象狀態［16］.同時Nuc具有很高的穩定性，與異源蛋白融合表達時可以降低胞內酶對目的蛋白的降解，并且不會影響目的蛋白的活性，因此，Nuc是一種非常理想的融合蛋白表達標簽［17］. Bermúdez-Humarán等［18］研究表明，在乳酸乳球菌中將E7與Nuc融合表達可以顯著提高E7表達產物的穩定性，使表達產量得到顯著提高，而未與Nuc融合的E7則易被胞內酶分解.鑒于此，本研究構建了兩種rPA表達質粒pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa，Western blot分析結果顯示，目的蛋白rPA和NucrPA均獲得表達，將rPA與Nuc進行融合表達可降低胞內酶對rPA的降解，提高了rPA的穩定性.溶栓活性實驗結果顯示，融合表達Nuc并沒有影響rPA的活性，并且，由于提高了rPA的表達量使得溶栓活性也增加了.

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責任編輯：周建軍

Expression of Reteplase in Lactococcus lactis

HE Yingying，LUO Xuegang，NI Meng，MA Deyun，WANG Chongxi，ZHANG Tongcun
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

To establish an expression system of reteplase（rPA）in lactic acid bacteria（LAB），rpa gene was amplified from pET22b-rpa，a recombinant plasmid constructed in our previous study.After that，the PCR product was ligated with Lactococcus lactis expression vector pCYT，which resulted in the recombinant plasmid pCYT-rpa. In order to improve the stability of rPA protein in L. lactis NZ9000，the rpa gene was also inserted into the downstream of thermostable Nuclease（Nuc）tag of Staphylococcal in the vector pCYT. The obtained recombinant plasmids pCYT-rpa and pCYT-nuc-rpa were respectively introduced into L. lactis NZ9000 through electroporation. After being induced by Nisin，the Western bolt was performed and the result showed that the Nuc did improve the stability of rPA protein in L. lactis，suggesting that Nuc-fusion could enhance the production of rPA in L. lactis. After being refolded，both recombinants rPA and Nuc-rPA exhibited thrombolysis activity，and the activities were 800，U/L and 1，000，U/L.

reteplase（rPA）；Nuc；Lactococcus lactis；expression

Q786 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0019-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20140008

瑞替普酶（reteplase，rPA）是人組織纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen activator，tPA）的截短突變體，是一種單鏈、非糖基化的蛋白.其保留了tPA的Kringle 2區和S區，保留了與纖維蛋白結合以及激活纖維蛋白酶原生物活性的能力.rPA屬于第三代溶栓藥，具有體內半衰期長、溶栓活性高、不良反應小等優點［1-2］.

目前，科研工作者已經在多種表達系統中對rPA的重組表達進行研究，但其效果均不甚理想：大腸桿菌細胞壁脂多糖是藥品內毒素的主要來源，rPA單劑用量通常又是其他重組蛋白如rhGCSF、INFa2b的30倍以上，因而對rPA大腸桿菌重組產品的純度及內毒素控制要求非常高.這造成生產后期純化工藝復雜，藥物成本增加［3-4］.而用酵母及哺乳動物細胞等真核表達系統表達rPA時，則時常由于發生錯誤的糖基化而造成其生物活性受到影響［5］，而且真核表達系統成本較高、生產周期長、產率較低，也使其難以很好地用于實際生產.

2014-01-17；

2014-05-22

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA022108，2012AA021505）；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”資助項目（IRT1166）

何影影（1987—），女，河北石家莊人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.