Stat3調控MMP9和TIMP1的轉錄與表達

顏廷寶，廖興華，周 浩，王 楠，張同存

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

Stat3調控MMP9和TIMP1的轉錄與表達

顏廷寶，廖興華，周 浩，王 楠，張同存

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

通過脂質體瞬時轉染Stat3重組質粒的方法在NIH3T3細胞中過表達Stat3；采用RT-PCR，Western blot以及熒光素酶活性分析的方法評估Stat3對MMP9及對其內源性抑制因子TIMP1的影響.結果表明：Stat3可增強MMP9及TIMP1基因啟動子的活性，促進兩者的轉錄與表達；并且Stat3對TIMP1的促進作用明顯強于對MMP9的促進作用，從而使ECM的降解能力減弱，細胞外基質成分積累，導致纖維化的發生.

信號轉導與轉錄激活因子3；金屬蛋白酶9；組織金屬蛋白酶抑制因子1；細胞外基質；轉錄調節

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒

pGL3-Basic熒光素酶報告基因載體購自美國Promega公司；表達質粒pcDNA3.1-Stat3由本實驗構建.

1.1.2 菌種及細胞系

E. coli菌株DH5α 由本實驗保存；小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3、人乳腺癌上皮細胞系MCF-7均購自美國模式菌種收集中心（ATCC）.

1.1.3 主要試劑

熒光素酶報告基因檢測試劑盒、T4，DNA連接酶，Promega公司；限制性內切酶、Turbofect、BCA蛋白定量試劑盒，Thermo Scientific公司；質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、Taq酶，TransGen公司；DMEM培養基，Gibco公司；胎牛血清，Hyclone公司；Trizol、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉錄酶、隨機引物，Invitrogen公司；一抗：anti-MMP9（sc-12759）、anti-TIMP1（sc-5538）、anti-β-actin（sc-47778），Santa Cruz公司；IRDyeTM680CW標記山羊抗兔二抗、IRDyeTM800CW標記山羊抗小鼠二抗，Li-COR公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

參照ATCC的細胞培養方法.NIH3T3用DMEM高糖培養基，添加體積分數10%的胎牛血清，培養于37，℃、CO2體積分數5%的環境中，每3，d換液，傳代.

1.2.2 RT-PCR檢測

將培養的NIH3T3細胞以每孔1×105的密度接種到6孔板中，過夜后進行細胞轉染.轉染24，h后，Trizol法提取細胞總RNA，參照逆轉錄系統說明書（Invitrogen）進行逆轉錄.每組取2，μg逆轉錄合成的cDNA，取1，μL產物進行RT-PCR 擴增，以GAPDH作為內對照.擴增體系為25，μL，包括雙蒸水16.5，μL，10，mmol/L dNTP 2，μL，上、下游引物各1，μL（100，μmol/L），10×PCR 緩沖液2.5，μL，模板、Taq酶各1，μL.PCR條件：95，℃預變性5，min，28個循環，每個循環95，℃變性30，s，相應退火溫度30，s，72，℃延伸45，s；最后72，℃延伸10，min.GAPDH（262，bp）：上游引物ATTCAACGGCACAGTCAA GG，下游引物GCAGAAGGGGCGGAGATGA；退火溫度54，℃.MMP9（158，bp）：上游引物TGGGACC ATCATAACATCAC，下游引物ATGACAATGTCCG CTTCG；退火溫度56，℃.TIMP1（162，bp）：上游引物TGGGAAATGCCGCAGATA，下游引物GCCAGGG AACCAAGAAGC；退火溫度55，℃.擴增產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離后用溴化乙錠染色觀察.

1.2.3 Western Blot檢測

Western Blot檢測方法主要參考前期文獻［10］進行.主用步驟如下：在10，cm細胞培養皿中，處理細胞融合到90%時，用600，μL裂解液（50，mmol/L Tris-HCl pH 7.5，體積分數1% Triton X-100，150，mmol/L NaCl，0.5，mmol/L EDTA，0.5，mmol/L PMSF）冰上裂解30，min.12，000，r/min離心10，min.取等量的細胞總蛋白（70，μg）用12% SDS-PAGE膠分離后，半干轉法印記到NC膜上.50，g/L脫脂奶粉室溫封閉2，h后，分別與鼠抗鼠MMP9單抗（1∶100）、兔抗鼠TIMP1多抗（1∶100）、鼠抗鼠β-actin單抗（1∶200）在4，℃孵育過夜.雜交膜用PBS洗3次，每次10，min，與IRDyeTM680，CW標記山羊抗兔（1∶10，000），IRDyeTM800，CW標記山羊抗小鼠（1∶10，000）室溫孵育1，h.再用PBS洗3次，每次10，min.用ECL遠紅外成像系統（Gene）觀察.

1.2.4 人基因組的提取

將鋪滿細胞培養皿的人乳腺癌上皮細胞系MCF-7用3，mL 2.5，g/L胰酶消化處理為細胞懸液加入到10，mL玻璃離心管中，1，000，r/min離心10，min，PBS洗滌2次.加入細胞裂解液，同時加入RNase至終質量濃度200，μg/mL，37，℃保溫60，min.加等體積苯酚/氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻，冰上水平靜置10，min.4，℃、10，000，r/min離心10，min，用擴口槍頭取出上清液.向上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻.4，℃、10，000，r/min離心10，min，用擴口槍頭取上清液.向上清液中加入1/10體積的3，mol/L CH3，COONa（pH 5.2）和2倍體積的無水乙醇.待DNA完全脫水，形成絲狀物后，用擴口槍頭吸出絲狀物于另一離心管中.絲狀物用1，mL 體積分數75%冷乙醇溶液洗2次，每次12，000，r/min離心5，min，棄上清液.超凈臺中稍干燥后，加入100，μL TE，40，℃溶解過夜，-20，℃保存.

1.2.5 質粒的構建

利用生物信息學手段，在NCBI網站獲得MMP9、TIMP1基因序列.分別設計啟動子擴增引物序列：MMP9（-1，074到+451）：上游引物CAAGGTACCATCATGGTCTTTTGGCAGGGTCT CG（KpnⅠ）；下游引物ATCTCGAGTGCCCCTGTTC ACTCCCAGCCTATG（XhoⅠ）.PCR反應條件：94，℃5，min（熱啟動），94，℃ 1，min（變性），57，℃ 90，s（退火），72，℃ 2，min（延伸），33次循環，72，℃ 10，min. TIMP1（-1，149到+51）：上游引物CGCTCGAGT TGTGTTCTTGTTATTGGGCTATC（XhoⅠ），下游引物TCAAGCTTGCATTACTCATCCACCCACCATTC（HindⅢ）.PCR反應條件：94，℃ 5，min（熱啟動），94，℃ 1，min（變性），56，℃ 1，min（退火），72，℃ 90，s（延伸），33次循環，72，℃ 10，min.以人基因組為模板，按上述PCR條件擴增后，純化PCR產物.用相應限制性內切酶酶切，將酶切產物與用同樣限制性內切酶酶切的pGL3-Basic質粒用T4，DNA連接酶在16，℃ 連接24，h.轉化DH5α，在氨芐霉素抗性平板上挑選單克隆后，在氨芐霉素抗性液體培養基LB中，37，℃擴大培養14，h后，提質粒，雙酶切驗證，測序.

1.2.6 瞬時共轉染實驗檢測熒光素酶報告基因的表達

將培養的NIH3T3細胞在轉染前12，h以每孔1×105的密度接種到24孔板中，待細胞融合到80%時更換為無血清DMEM培養基，按Turbofect使用說明進行細胞轉染.實驗組：啟動子（pGL3-Basic-p-MMP9或pGL3-Basic-p-TIMP1）0.5，μg，pcDNA3.1-Stat3表達質粒0.5，μg，pcDNA3.1對照質粒0.5，μg，2，μL脂質體；對照組：啟動子（pGL3-Basic-p-MMP9或pGL3-Basic-p-TIMP1）0.5，μg，pcDNA3.1對照質粒1.0，μg，2，μL脂質體.無血清孵育6，h后，換含10%（體積分數）血清的DMEM培養24，h后，檢測熒光素酶活性.實驗步驟按照熒光素酶報告檢測系統說明書進行.用Synergy4多功能酶標儀（Gene）測定螢光素酶的活性，蛋白質定量試劑盒檢測蛋白質含量，進而計算相對熒光素酶的活性.

1.2.7 統計學處理

所有數據均運用統計軟件SPSS 12.0，采用單因素方差分析least significant difference（LSD）進行組間比較，*代表P＜0.05，為具有顯著性差異.

2 結果與分析

已有研究［11］表明MMP2可能是Stat3的下游靶基因，Stat3激活后入核，結合到MMP2的啟動子上通過轉錄調節調控MMP2基因的表達.那么，與MMP2有較高序列相似性的MMP9是否也受Stat3的調控？另外，激活的基質金屬蛋白酶主要是被特異的TIMPs所抑制.TIMPs是組織中MMPs主要的內源性抑制因子，現已發現的4種TIMPs對目前已知的MMPs均具有抑制作用［4］.因此，也有必要考察Stat3對MMP9的內源性抑制因子TIMP1的影響.

2.1 Stat3對MMP9基因與TIMP1基因mRNA水平的影響

首先通過脂質體轉染Stat3重組蛋白表達質粒的方法在NIH3T3細胞中過表達了Stat3基因.轉染24，h后，提取細胞總RNA逆轉錄成cDNA后RTPCR分析，結果顯示：與pcDNA3.1對照組相比，過表達Stat3后MMP9與TIMP1基因mRNA水平均有明顯升高（圖1（a）、（b））.由于TIMP1可以通過與MMP9形成1∶1復合物的形式抑制其活性，因此當機體MMP9表達增強時，TIMP1的表達也會隨之增強，以平衡MMP9對細胞外基質的降解功能.同理，當TIMP1表達增強時，MMP9也有可能出現代償性升高.在肺癌［12］、急性冠狀動脈綜合癥［13］等多種疾病的研究中，患者組的MMP9與TIMP1均高于正常對照組，因此TIMP1與MMP9的比值（TIMP1/MMP9）的變化更具有生理意義，也通常被用作多種疾病的判斷依據.實驗結果表明：過表達Stat3后，TIMP1與MMP9，PCR條帶相對密度的比值（TIMP1/MMP9）明顯被上調，且大于1（圖1（c））.

圖1 Stat3對MMP9及TIMP1基因mRNA水平的影響Fig. 1 Effect of Stat3 on the mRNA level of MMP9 and TIMP1 genes

2.2 Stat3對MMP9基因與TIMP1基因蛋白水平的影響

通過脂質體轉染Stat3重組蛋白表達質粒的方法在NIH3，T3細胞中過表達Stat3基因，48，h后，提取細胞總蛋白，經SDS-PGAE電泳后，Western blot檢測，結果顯示：與pcDNA3.1對照組相比，過表達Stat3基因后，MMP9與TIMP1蛋白表達水平均明顯升高，具有統計學意義（圖2（a）、（b）），并且TIMP1與MMP9蛋白條帶相對密度的比值（TIMP1/MMP9）明顯上調（圖2（c））.

圖2 Stat3對MMP9及TIMP1基因蛋白水平的影響Fig. 2Effect of Stat3 on the protein expression level of MMP9 and TIMP1

2.3 MMP9及TIMP1啟動子熒光素酶重組報告基因質粒的構建

為進一步研究Stat3對MMP9與TIMP1基因調控的機制.通過生物信息學方法從NCBI數據庫獲得了MMP9及TIMP1啟動子目的序列：MMP9（-1，074到+451）、TIMP1（-1，149到+51）.從人乳腺癌上皮細胞系（MCF-7）中獲得人的基因組序列后，利用PCR方法獲得目的基因片段.由圖3（a）可見MMP9在1，500，bp上方有一條目的條帶，與設計大小1，543，bp基本一致；TIMP1在1，000，bp與1，500，bp之間有一條帶，與設計大小1，220，bp基本一致.連接T載體后測序，均證實為所需目的片段.

圖3 重組質粒的構建Fig. 3 Construction of recombinant plasmids

將pGL3-Basic質粒與MMP9啟動子的PCR片段用KpnⅠ和XhoⅠ酶切；將pGL3-Basic質粒與TIMP1啟動子的PCR片段用XhoⅠ和HindⅢ酶切純化后，按連接反應體系進行連接，轉化后于氨芐霉素陽性篩選平板中挑選單菌落，即獲得轉化子.轉化子經雙酶切驗證如圖3（b）所示：pGL3-Basic-p-MMP9轉化子經KpnⅠ與XhoⅠ雙酶酶切后可見兩條條帶，一條與pGL3單酶切線性條帶大小一致，一條與MMP9 PCR產物條帶一致，初步說明重組質粒構建成功，經測序證實無誤；同樣pGL3-Basic-p-TIMP1轉化子經XhoⅠ與HindⅢ雙酶酶切后可見兩條條帶，一條與pGL3單酶切線性條帶大小一致，一條與TIMP1 PCR產物條帶一致，初步說明重組質粒構建成功，經測序證實無誤.

2.4 Stat3對MMP9基因及TIMP1基因啟動子活性的影響

熒光素酶活性分析結果顯示：與轉染pcDNA3.1對照組相比，過表達Stat3基因后MMP9與TIMP1啟動子熒光素酶活性均有所升高（圖4（a））.實驗中發現在mRNA水平、蛋白水平以及啟動子水平Stat3均可以上調MMP9與TIMP1的表達.因此，可以初步斷定MMP9及TIMP1的轉錄和表達受Stat3的調控，并且這種調控作用可能是通過調節啟動子的活性引起的.

圖4 Stat3對MMP9及TIMP1啟動子的熒光素酶活性的影響Fig. 4 Effect of Stat3 on relative luciferase activities of MMP9 and TIMP1 promoters

通過對兩者熒光素酶相對活性的比值（TIMP1/ MMP9）的考察發現：Stat3仍然可以上調TIMP1與MMP9熒光素酶相對活性的比值（TIMP1/MMP9）（圖4（b））.在mRNA水平（圖1（c））、蛋白水平（圖2（c））以及啟動子活性水平（圖4（b）），與pcDNA3.1對照組相比，過表達Stat3后TIMP1與MMP9的比值（TIMP1/MMP9）均有明顯的升高（P＜0.05），且均大于1，說明Stat3對TIMP1的促進作用明顯大于MMP9.這提示我們在NIH3T3細胞中過表達Stat3后，可能會促進細胞外基質機制（ECM）的積累.

3 結 論

Stat3可以通過增強啟動子的活性調控ECM的降解酶（MMP9）及其內源性抑制因子（TIMP1），促進兩者的轉錄與表達，并影響兩者之間的比值.由此說明Stat3處于細胞外基質（ECM）調控網絡的關鍵節點，提示我們Stat3基因表達量的變化對心肌纖維化病理過程的發生有著重要的影響.這對心肌纖維化病理機制的研究以及抗心肌纖維化藥物的研發具有重要的理論意義.

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責任編輯：周建軍

Regulating the Transcription and Expression of Matrix Metalloproteinase-9（MMP9）and the Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1（TIMP1） with Stat3

YAN Tingbao，LIAO Xinghua，ZHOU Hao，WANG Nan，ZHANG Tongcun
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Gene Stat3 was overexpressed in NIH3T3 cells by lipofection transfection，and the effect of Stat3 on the expression of MMP9 and its inhibitor TIMP1 was estimated by RT-PCR，Western Blot and Luciferase Assay. The results show that Stat3 is able to upregulate the transcription and expression of MMP9 and TIMP1 by enhancing their promoter activities and the enhancement of TIMP1 expression induced by Stat3 is stronger than MMP9. It suggests that overexpression of Stat3 may inhibit the degradation of ECM in NIH3T3 cells and promote the development of fibrosis.

signal transducer and activator of transcription-3；matrix metalloproteinase-9；tissue inhibitor of metalloproteinase-1；extracellular matrix；transcription regulation

Q78 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0029-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140017

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是指位于機體細胞外的非細胞性的有形或無定形成分.ECM的代謝包括ECM的合成與降解，ECM合成與降解失衡是心肌纖維化形成的基礎［1］.ECM主要包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖及彈性蛋白.膠原是構成ECM的重要蛋白質［2］.ECM的降解依賴ECM降解蛋白酶，其目前主要分為3個類別：基質金屬蛋白酶類（matrix metalloproteinases，MMPs）、絲氨酸蛋白酶類及半胱氨酸蛋白酶類.有資料［3］表明MMPs在ECM降解中起關鍵作用.按照作用底物不同，MMPs可分為4類：間質膠原酶、基質溶解素、明膠酶以及膜型金屬蛋白酶.其中MMP9是MMPs家族中相對分子質量最大的酶，屬于明膠酶，主要作用于Ⅳ型膠原與變性膠原及彈力蛋白，是水解ECM的重要蛋白水解酶，在腫瘤的侵襲、轉移過程中發揮著非常重要的作用［4］.

MMPs的活性受到3個水平的調控［5］：酶原合成的調控、酶原激活的調控以及抑制劑對其活性的調控.MMPs合成后以無活性的酶原的形式分泌到胞外，經組織或血漿纖溶酶原-纖溶酶系統（t-PA）等多種酶原激活途徑的激活發揮生物學活性，這是一個復雜的胞外過程.信號轉導與轉錄激活因子3（Stat3）屬于細胞信號轉導與轉錄激活因子（STAT）蛋白家族，該家族可被不同的細胞因子受體激活，是一類活化后能轉入細胞核內與相應的DNA結合的蛋白家族，具有信號轉導和轉錄調控的雙重功能［6］.Stat3是胞外信號傳遞入核進而發揮作用的一個重要因子.其被證實與細胞保護、腫瘤遷移、血管重構等多種涉及ECM變化的生理過程相關［7-9］.而有關Stat3直接對于MMPs的影響的報道仍然較少.因此，本文主要從轉錄調節角度評估Stat3對MMP9及其內源性抑制因子——組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP1）的調控作用.

2014-02-26；

2014-04-11

國家自然科學基金資助項目（31270837）；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”資助項目（IRT1166）

顏廷寶（1987—），男，河北滄州人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.