一種基于熒光檢測的GST-pull down改進方法的建立及對Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

王重喜，羅學剛，李朋彥，陳小穎，周 浩，張同存，

（1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 武漢科技大學生物醫學研究院，武漢 430000）

一種基于熒光檢測的GST-pull down改進方法的建立及對Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

王重喜1，羅學剛1，李朋彥1，陳小穎1，周 浩1，張同存1，2

（1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 武漢科技大學生物醫學研究院，武漢 430000）

創建一種基于熒光檢測的GST-pull down改進方法，用于蛋白質間相互作用分析.利用已確定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白對作為實驗對象，分別構建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表達體系.將純化的GST-Atsttrin與TNFR2-EYFP蛋白孵育后，經離心收集復合物，通過酶標儀檢測其熒光值，從而分析Atsttrin和TNFR2間的相互作用.通過熒光值的檢測成功分析了Atsttrin和TNFR2間的相互作用，熒光值的檢測可代替傳統方法中的Western blot分析，從而簡化GST-pull down分析步驟、降低操作難度、并可對缺乏特異性抗體的靶蛋白進行有效地分析.

蛋白質相互作用；熒光檢測；GST-pull down

EYFP作為EGFP蛋白的改進型，可在500，nm的激發光激發下產生528，nm的發射光，因其易于檢測，熒光強、發光穩定、沒有細胞種類和位置上的限制且載體易于構建，在生物大分子標記和蛋白間相互作用中都有重要應用［6-7］.實驗示意圖如圖1所示.

圖1 基于熒光檢測的GST-pull down方法示意圖Fig. 1 Schema of the GST-pull down based on fluorescence detection

本實驗選用已確定能發生相互作用的蛋白對Atsttrin和腫瘤壞死因子受體2（Tumor necrosis factor receptor 2，TNFR2）［8-9］作為實驗對象，分別構建GSTAtsttrin原核表達載體和TNFR2-EYFP真核表達載體，并在大腸桿菌及哺乳動物細胞中進行表達.將原核表達的GST-Atsttrin融合蛋白親和固定到GST樹脂上，再向其中加入含有TNFR2-EYFP融合蛋白的細胞裂解液.因Atsttrin和TNFR2間的相互作用而形成樹脂-GST-Atsttrin-TNFR2-EYFP復合物，在GST樹脂的重力作用下瞬時離心可以得到該復合物.最后利用EYFP的熒光特性，在多功能酶標儀上用500，nm的激發光激發，檢測528，nm發射光的熒光值，即可實現對蛋白質間相互作用的分析.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、質粒及菌株

人正常乳腺細胞（HBL100）、非洲綠猴腎成纖維細胞（COS-7）、質粒pGEX-6p-3及pEYFP-N1均為本實驗室保存；質粒pMD18T-Atsttrin為實驗室前期構建；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109和BL21（DE3）由本實驗室保存.

1.1.2 主要試劑

Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶，TaKaRa公司；核酸Marker、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，北京康為世紀公司；High-Affinity GST Resin，南京金斯瑞生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和IPTG，北京索萊寶公司；細胞培養基，Gibco公司；細胞胎牛血清，杭州四季青公司；核酸限制性內切酶、蛋白Marker、TuroFect細胞轉染試劑，Fermentas公司；實驗所用其余試劑均為進口或國產分析純試劑.引物合成及序列測序由北京英濰捷基公司完成.

1.2 方法

1.2.1 質粒pEYFP-TNFR2構建及鑒定

根據Uniprot提供的TNFR2胞外域蛋白序列（P20333）和NCBI提供的TNFR2基因序列（Gene ID：7133），克隆其胞外域23到257位部分.利用Primer 5.0軟件設計引物擴增TNFR2，酶切位點用下劃線表示，P1：5'-TAGGAATTC GCCACCATGTTGC CCGCCCAGGTG-3'（EcoRⅠ），P2：5'-GGAGGATCC GAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAG-3'（BamHⅠ）.實驗中選用人正常乳腺細胞（HBL100）的cDNA作為模板，擴增目的基因TNFR2.將PCR產物和載體pEYFP-N1分別雙酶切，切膠回收，經T4，DNA連接酶連接后轉化E. coli JM109感受態細胞.經卡那霉素抗性篩選，挑取單克隆進行菌落PCR及雙酶切驗證，驗證正確后經測序鑒定.

1.2.2 質粒pGEX-Atsttrin構建及鑒定

以pMD18T-Atsttrin為模板，通過PCR方法擴增Atsttrin基因.所用引物為P3：5'-TCGGGATCC GAAAA TCTGTATTTTCAGGGCCCGCAGGCTTCCTGCTGT G-3'（BamHⅠ），P4：5'-CCGCTCGAGTTATGGGATT GGACAGCAGC-3'（XhoⅠ）.為方便在今后的引物中切割去除GST標簽，在上游引物中引入TEV蛋白酶的切割位點（斜體部分）.將PCR產物和pGEX-6p-3載體分別雙酶切，切膠回收，連接轉化E. coli JM109感受態細胞.經氨芐青霉素（Amp）抗性篩選后，利用菌落PCR、雙酶切及測序鑒定陽性克隆.

1.2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的誘導表達和優化

燒傷在臨床上較為多見,一般小面積的Ⅰ度燒傷多半能自愈,但是如果燒傷面積在Ⅱ、Ⅲ度燒傷,易導致創面出現感染,延長患者的住院時間,因此,創面的處理好壞與燒傷后的感染、病程、功能恢復都有著密切的聯系,直接影響病情的發展。因此,對于燒傷患者正確的創面處理,合理的外用藥物選擇都將是燒傷患者治愈的關鍵環節[1]。對此,本次研究就選取了我院96例(2015年11月-2017年5月)燒傷患者,分別選用了1%磺胺嘧啶銀霜和磺胺嘧啶銀鋅霜兩種藥物進行治療,分析以上兩種藥物對燒傷患者的臨床治療效果的影響,現報道如下。

重組質粒pGEX-Atsttrin轉化E. coli BL21（DE3），將轉化后的重組表達菌株接種于含Amp（100，μg/mL）的LB液體培養基中，37，℃振蕩培養過夜后以2%接種量接種于50，mL含Amp（100，μg/mL）的新鮮LB液體培養基中（250，mL搖瓶），于37，℃培養至A600為0.6～0.8時（約2，h），加入終濃度為1.0，mmol/L的IPTG，30，℃誘導培養4，h.同時以空質粒pGEX-6P-3轉化E. coli BL21（DE3）誘導培養作為陰性對照.

誘導時間優化：在30，℃條件下，加入終濃度為1.0，mmol/L的IPTG誘導培養，分別誘導1、2、4、6、8，h后取樣用于SDS-PAGE分析.

誘導劑濃度優化：分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，mmol/L的IPTG，30，℃誘導培養，用SDS-PAGE分析目的蛋白表達情況.

1.2.4 GST-Atsttrin融合蛋白純化

誘導完畢，4，℃離心收集菌體，用PBS洗滌3次.每100，mg濕菌體加3.3，mL PBS將菌體重懸并超聲破碎，4，℃、12，000，r/min離心30，min收集上清液，并用0.45，μm濾膜過濾.用4，℃預冷的PBS平衡GST樹脂后，將上清液蛋白上柱純化.再次用4，℃預冷的PBS洗滌雜蛋白后，取少量與GST-Atsttrin融合蛋白結合的GST樹脂用于SDS-PAGE分析，其余4，℃儲存用于后續實驗.

1.2.5 細胞轉染及TNFR2-EYFP融合蛋白的制備

按照脂質體轉染試劑說明書操作，將質粒pEYFP-TNFR2轉染COS-7細胞.培養24，h后，棄培養基，用PBS洗滌細胞兩次，加入1.0，mL細胞裂解液（4，℃預冷），置于冰上裂解30，min后，13，000，r/min離心10，min收集上清液蛋白.

1.2.6 GST-Atstttrin和TNFR2-EYFP相互作用

將50，μL 1.2.4節所得GST樹脂加入到500，μL 1.2.5節所得上清液蛋白中，置于旋轉搖床，4，℃孵育12，h.800，r/min短暫離心20，s后棄上清液蛋白，用1，mL NETN細胞裂解液（4，℃預冷）重復洗滌3次，用200，μL PBS吹懸樹脂.將所得樹脂加入到96孔熒光檢測板中，在多功能酶標儀（Bioteck）上用500，nm的激發光激發，檢測528，nm發射光的熒光值.

2 結 果

2.1 重組質粒pEYFP-TNFR2和pGEX-Atsttrin的構建及鑒定

以HBL100細胞的cDNA為模板，用引物P1和P2擴增TNFR2基因，并定向克隆到載體EcoRⅠ和BamHⅠ之間.PCR后可擴增出與預期大小相符的目的條帶，且重組質粒經雙酶切可檢測到目的條帶（圖2（a））.另一方面，以pMD18T-Atsttrin為模板，用引物P3和P4擴增Atsttrin基因并亞克隆到pGEX-6P-3質粒中.重組質粒經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后可檢測到與預期大小相符的目的條帶（圖2（b））.進一步通過測序證實，重組質粒pEYFP-TNFR2和pGEXAtsttrin均構建成功.

圖2 質粒構建Fig. 2 The construction of recombinant vectors

2.2 GST-Atsttrin融合蛋白的誘導表達

質粒pGEX-6p-3和pGEX-Atsttrin分別轉化E. coli BL21（DE3），IPTG誘導表達，GST-Atsttrin融合蛋白誘導表達與可溶性分析如圖3所示.重組菌株經IPTG誘導后在相對分子質量4.3×104處可見GST-Atsttrin融合蛋白條帶（GST蛋白相對分子質量約2.6×104，Atsttrin蛋白相對分子質量約1.7× 104）.進一步對菌體超聲破碎后所獲得的上清和沉淀進行電泳分析，結果顯示目的蛋白可溶率達90%.

圖3 GST-Atsttrin融合蛋白誘導表達與可溶性分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression and solubility of GST-Atsttrin fusion protein

為進一步優化誘導表達條件，首先將重組菌株E. coli BL21（DE3）/pGEX-Atsttrin以1.0，mmol/L的IPTG 30，℃誘導培養8，h，每2，h取樣分析.SDS-PAGE電泳結果顯示重組蛋白的可溶性表達量隨誘導時間延長而增加，誘導6，h時融合蛋白有最大的表達量（圖4（a））.進而分別在30，℃以終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，mmol/L的IPTG條件下誘導培養6，h，結果表明0.6，mmol/L的IPTG對菌體誘導效果最好（圖4（b））.對優化后融合蛋白的可溶性進行分析，結果顯示目的蛋白依然具有很好的可溶性（圖5）.因而確定GST-Atsttrin融合蛋白誘導表達的最優條件為30，℃，以0.6，mmol/L的IPTG誘導6，h. Quantity one軟件分析顯示可溶性融合蛋白的量可占菌體總蛋白的30%以上.

圖4 誘導表達時間及IPTG濃度的優化Fig. 4Optimization of the induction time and concentration of IPTG

圖5 優化后蛋白可溶性分析Fig. 5Analysis of the solubility of GST-Atsttrin fusion protein

2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的純化

將誘導菌體超聲破碎后，離心取上清于GST親和層析柱純化融合蛋白.SDS-PAGE分析結果顯示：通過一次親和層析可除去絕大多數的雜蛋白，但在相對分子質量為2.8×104的附近依然存在一條雜蛋白帶，其位置與空質粒pGEX-6P-3誘導表達的GST產物相同（圖6，圖3（a））.由此表明重組菌株E. coli BL21（DE3）/pGEX-Atsttrin在表達融合蛋白的同時，也會產生一定的GST單獨表達產物.這很可能是由于人源基因Atsttrin密碼子與E. coli偏愛性間所存在的差異造成翻譯出現中斷或外源基因mRNA不穩定發生斷裂而造成的.

圖6 GST-Atsttrin融合蛋白的純化Fig. 6 Purification of the GST-Atsttrin fusion protein

2.4 細胞轉染及TNFR2-EYFP融合蛋白的熒光檢測

將質粒pEYFP-TNFR2轉染COS-7細胞，培養24，h后，通過熒光顯微鏡分析TNFR2-EYFP目的蛋白的表達情況，結果如圖7所示.

圖7 細胞轉染pEYFP-TNFR2質粒后熒光圖片Fig. 7 Micrographs of cells transfected with pEYFPTNFR2 vector

轉染細胞可觀測到明顯的熒光，表明融合蛋白在細胞內可獲得很好地表達.進一步收集轉染后的細胞，裂解收取上清獲得TNFR2-EYFP樣品，利用多功能酶標儀對熒光信號進行定量分析，結果如圖8所示.結果顯示細胞裂解液試劑對熒光值的測定沒有影響；同時，熒光值與融合蛋白TNFR2-EYFP樣品間具有良好的劑量依賴關系，表明熒光值的強弱可以很好地反映出EYFP融合蛋白的含量高低.

圖8 TNFR2-EYFP融合蛋白的熒光值與其劑量間的關系Fig. 8Relationship between the fluorescence of TNFR2-EYFP fusion protein and its amount

2.5 Atsttrin和TNFR2相互作用分析

為驗證熒光測定方法是否可很好地用于蛋白質間相互作用的GST-pull down分析，首先對GST-pull down系統所涉及到的COS-7細胞及E. coli內源性雜蛋白、GST標簽蛋白及樹脂對EYFP熒光測定是否會產生干擾進行了分析.與對照組相比上述“雜質”均不會對EYFP熒光值的測定產生顯著性的影響（圖9（a））.在此基礎上，分別將Atsttrin-GST-樹脂復合物、GST-樹脂復合物與轉染pEYFP-TNFR2的細胞裂解液共同孵育，短暫離心并用PBS清洗GST樹脂后，于多功能酶標儀中測定EYFP的熒光值.與GST-樹脂復合物相比，Atsttrin-GST-樹脂復合物在與pEYFP-TNFR2細胞裂解液孵育后，可檢測到明顯的熒光信號（圖9（b）），表明Atsttrin-GST-樹脂復合物可將TNFR2-EYFP從細胞裂解液中捕獲富集出來，且熒光檢測法能夠很好地檢測這一過程.改進后的方法可很好地用于蛋白質間相互作用的分析.

圖9 Atsttrin和TNFR2相互作用分析Fig. 9 Interaction analysis of Atsttrin and TNFR2

3 討 論

相比酵母雙雜交、Co-IP、FRET等方法，GST-pull down簡便易行、實驗重現性好，因此在蛋白質相互作用分析方面得到了廣泛的應用.本研究在傳統GST-pull down方法基礎上，對其進行了改進.通過將靶蛋白與EYFP融合表達，以EYFP熒光值的檢測代替傳統方法中的SDS-PAGE及Western blot分析，從而大大簡化了GST-pull down分析步驟、降低了操作難度、并可對缺乏特異性抗體的靶蛋白進行有效的分析.本研究結果顯示EYFP的熒光值與EYFP融合蛋白的含量間具有良好的劑量依賴關系，且整個實驗體系中可能存在的真核細胞及E. coli的內源性物質、GST蛋白、親和樹脂、細胞裂解液等“雜質”均不會對EYFP熒光測定產生顯著性影響，因此本方法可很好地通過檢測EYFP熒光值的大小實現對蛋白質間相互作用的分析.

正確空間結構的形成對于蛋白質相互作用的體外分析十分重要［4］.GST是E. coli天然高效、可溶性表達的蛋白質，在作為融合表達標簽時可促進目的蛋白質二硫鍵的形成，從而使表達產物折疊形成正確的空間結構［5，10］.此外，GST還有利于增強融合蛋白的翻譯效率及穩定性，從而大大提高表達水平［11］.在本實驗中，經過條件優化，在30，℃、IPTG濃度為0.6，mmol/L時誘導培養6，h，可確保GST-Atsttrin融合蛋白的表達量達到最大（250，mg/mL），同時可溶性蛋白比率可高達90%以上，確保了相互作用分析的正確性.

在本實驗中選用的研究對象Atsttrin是新近報道的TNFR2特異性拮抗蛋白［8-9］.TNFα 作為促炎因子，在類風濕性關節炎（rheumatoid arthrits，RA）、銀屑病性關節炎（psoriasis arthritsi，PA）、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）等免疫系統疾病過程中起著重要作用［12-13］.相比于TNFR1，TNFR2相對有限的細胞分布，使得TNFR2成為更為特異、安全的治療靶點［14-15］.Atsttrin可與TNFα 競爭對TNFR2的結合，從而有效發揮對類風濕性關節炎的高效抑制作用［8-9］.不僅如此，藥物動力學分析表明Atsttrin在體內具有較為理想的消除半衰期和生物利用度，表明Atsttrin及其衍生物將是有潛力的抗關節炎新藥［8-9］.本文改進后的GST-pull down方法可為Atsttrin蛋白質序列的進一步優化以及新型抗關節炎新藥的篩選提供一種新的有力手段.此外，在質粒構建時，還在GST與Atsttrin之間添加了TEV蛋白酶的切割位點，后續亦可通過TEV酶切釋放Atsttrin，用于該蛋白質的制備生產.

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責任編輯：周建軍

An Improved Method of GST-pull Down Based on Fluorescence Detection and its Application to the Analysis of the Interaction between Atsttrin and TNFR2

WANG Chongxi1，LUO Xuegang1，LI Pengyan1，CHEN Xiaoying1，ZHOU Hao1，ZHANG Tongcun1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Institute of Biology and Medicine，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430000，China）

An improved method of GST-pull down based on fluorescence detection was developed and could be applied to analyzing protein interaction. Based on the confirmed interaction between TNFR2 and Atsttrin，recombinant expression vectors pGEX-Atsttrin and pEYFP-TNFR2 were constructed. GST-Atsttrin fusion proteins were purified by affinity chromatography，and then incubated with TNFR2-EYFP fusion proteins. After centrifugation，the complex was collected，and the interaction between Atsttrin and TNFR2-EYFP was analyzed through measuring the fluorescence intensity with multifunctional microplate reader. The interaction between Atsttrin and TNFR2 was verified by the detection of the fluorescence after the GST-pull down. Compared with the traditional method，the new method was more convenient and could be used to analyze the target protein without specific antibodies.

protein interaction；fluorescence detection；GST-pull down

Q71 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0034-07

10.13364/j.issn.1672-6510.20140062

蛋白質間的相互作用在生物細胞的生命活動中發揮著重要作用，研究蛋白質間的相互作用，對于蛋白質功能的分析、疾病機理的闡明和新藥的研發具有十分重要的意義［1-2］.目前常用的研究蛋白質間相互作用的方法主要有酵母雙雜交、GST-pull down、免疫共沉淀（Co-IP）和熒光能量共振轉移（FRET）等［3］.其中，GST-pull down技術是利用谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）與谷胱甘肽間的特異性結合，研究蛋白質體外直接相互作用的重要手段［2，4］.其基本原理［3，5］是將目的蛋白與GST標簽融合表達，將得到的融合蛋白親和固定到谷胱甘肽樹脂上當作“誘餌蛋白”，加入另一種蛋白溶液后，由于蛋白質間的相互作用，可從中捕獲出能與目的蛋白相互作用的“靶蛋白”，而形成GST-誘餌蛋白-靶蛋白的復合物.收集復合物后通過SDS-PAGE或Western blot檢測靶蛋白的存在，從而分析證實目的蛋白和靶蛋白間的相互作用.然而，SDS-PAGE分析對靶蛋白的測定特異性較低，而Western blot檢測則步驟繁瑣、操作難度較大、成本較高，而且無法適用于缺乏特異性抗體的靶蛋白（如新發現的蛋白質或免疫原性較弱的蛋白質）的分析，因此該方法需進一步改良.

2014-04-19；

2014-06-25

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA021505）；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”資助項目（IRT1166）

王重喜（1989—），男，碩士研究生；通信作者：羅學剛，副教授，luoxuegang@hotmail.com.