蝴蝶蘭組培瓶苗的微生物污染防治研究

薄維超,李謝,鄭霞,羅 麗（連云港師范高等專科學校,江蘇 連云港 222000）

蝴蝶蘭組培瓶苗的微生物污染防治研究

薄維超,李謝,鄭霞,羅 麗
（連云港師范高等專科學校,江蘇 連云港 222000）

摘要：對工廠化快速繁殖蝴蝶蘭過程中出現的組培瓶苗污染問題開展研究工作。分離純化得到6種污染微生物，采用濾紙片法篩選出100mg/L鏈霉素+100mg/L硫酸慶大霉素+100mg/L苯甲酸為最佳使用抑菌劑組合，并且對蝴蝶蘭苗的增殖影響不大。

關鍵詞：蝴蝶蘭；組培瓶苗；污染；防治

蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrids）是名貴花卉之一，以花大、色艷、花期長而著稱，具有很高的觀賞價值。蝴蝶蘭屬單莖氣生蘭，極少發育側枝，難以進行常規的無性繁殖。通過組織培養技術可以在短期內快速繁殖獲得大量幼小植株，適應市場的大量需求，也是工廠化育苗的重要途徑。工廠化育苗為保證母株的優良特點，如花型、花色等商品要求，需要采用花梗上的營養芽作為原代培養的起始材料，將花梗截取成每段帶單芽的4-5cm小梗，接種至原代培養基中誘導單芽萌發；當單芽萌發生長具有長度達到1cm的1葉時，切割除去花梗，取生長的芽轉接到初代培養基中增高和壯芽培養1個月；切去培養壯實的芽苗葉片和頂芽以去除頂端優勢，然后將不高的莖段沿著節間分割，將帶有腋芽的每節段，培養到增殖培養基中誘導多芽的產生，通常單次增殖率小于等于3，繼代培養次數不超過8次，以免畸形芽的產生；通過不斷的增殖實現快速繁殖；再通過壯苗、生根、煉苗等培養方可出瓶進入溫室培養階段。在蝴蝶蘭的整個快速繁殖培養過程中都可能出現污染[1]。本文主要是對蝴蝶蘭瓶苗增殖培養過程中的污染進行研究。

1 試驗器材

1.1 實驗材料和試劑

蝴蝶蘭污染瓶苗（由連云港振興蘭業股份有限公司組培中心提供）。

革蘭氏染色試劑盒、鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸（均購自上海國藥集團）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基

（1）蝴蝶蘭增殖培養基：花寶1號+6-BA3mg/L+NAA0.5mg+蔗糖3%+活性炭4g/L+馬鈴薯10%+瓊脂0.8%,pH5.8。（2）牛肉膏蛋白胨固體培養基。（3）PDA固體培養基。

1.2.2 菌種分離與純化

（1）平板劃線分離：在污染的瓶苗培養基中挑取出污染菌，分別在牛肉膏蛋白胨固體培養基平板和PDA固體培養基平板上劃線分離。蠟膜封口，倒扣于溫箱中培養。前者培養溫度為37℃，3-5d；后者為28℃，7-10d。

（2）平板劃線純化：刮取平板上的單菌落上的少量細胞，劃線純化培養2次，以得到純化菌種，將純化的菌種接種于蝴蝶蘭增殖培養基中復感染培養，觀察菌落的形態是否與取樣時瓶苗內的污染一致。25℃培養室培養，光照1500lux，光周期16h/d，培養10-15d。對復感染一致的菌種進行編號，4℃保存。

1.2.3 純化菌種的初步鑒定

（1）菌落形態觀察：將活化的菌種平板劃線培養2-10d，觀察單菌落的生長形態并記錄。

（2）對污染細菌進行鑒定：對獲得的純化菌進行革蘭氏染色鏡檢，確定基本形態大小和革蘭氏屬性。

1）確定形態大小：觀察形態,使用顯微測微尺對革蘭氏染色涂片上的菌體細胞進行大小測量。

2）確定革蘭氏屬性：對制作的涂片進行革蘭氏染色，鏡檢結果，藍紫色為G+，紫紅色為G—。

（3）對污染真菌進行鑒定：制作水浸片染色鏡檢觀察菌絲及繁殖器特征，查閱《真菌鑒定手冊》確定屬。

1.2.4 平板抑菌實驗

采用濾紙片法以鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸等及混合抑菌劑對分離到的菌種進行抑菌實驗，采用的平板培養基為蝴蝶蘭增殖培養基[2]。

（1）菌種活化：將保存在冰箱4℃的分離純化菌種轉接到蝴蝶蘭增殖培養基平板上，細菌類37℃培養48h，真菌類培養28℃培養4-7d。

（2）制備菌懸液．

（3）紙片法抑菌實驗．

1.2.5 抑菌劑對組培苗生長的影響

觀察優化抑菌劑組合對蝴蝶蘭組培苗生長發育的影響。通過統計新生葉數、新生根數、芽增殖倍數等評價混合抑菌劑對蝴蝶蘭組培苗生長的影響[3]。

2 實驗結果及分析

2.1 微生物的形態特征及鑒定

分離的污染微生物菌種特征如下表。

表1 分離污染菌的形態特征

從表中可以判斷出，1號和2號菌為細菌，3號為酵母菌，4,、5 和6號為霉菌。其中1號為桿菌，G-,2號為球菌，G+。對霉菌的產孢子梗進一步觀察可以鑒別出菌屬，見表2。

表2 三類污染霉菌的產孢子梗形態

從表2列出的三類霉菌分生孢子梗特征，綜合菌落特征，菌絲特點。查閱《真菌鑒定手冊》可以判斷出4號為綠色木霉，5號為黑曲霉，6號為青霉。

2.2 濾紙片法抑菌實驗結果分析

經過表1和表2的結果，可知有2種細菌、1種酵母菌和3種霉菌。選用了鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸三種藥品進行抑菌實驗。鏈霉素主要作用于細菌核糖體，影響蛋白質的合成功能。故4、5和6號沒有用該藥品處理。青霉素主要作用于革蘭氏陽性細菌細胞壁的肽聚糖，由于3、4、5、6號為真菌，細胞壁中沒有肽聚糖成分，故沒有用該藥品處理。硫酸慶大霉素主要作用于細菌蛋白質合成有關的核糖體亞基，對真菌無效，故3、4、5、6號未用該藥品處理。

結果見下表3。

表3 濾紙片法抑菌實驗

從上表可以看出，四種藥品中青霉素的效果最差，因為它主要作用于革蘭氏陽性細菌細胞壁上的肽聚糖，革蘭氏陰性細菌細胞壁中肽聚糖含量較少，故對2號的抑制效果由于對1號菌。其它三種藥品又以苯甲酸的抑菌效果最全面，對6種菌均有抑制作用，而且效果較好。當這三種藥品達到200mg/L時均有較好的抑菌效果。但是考慮到單獨使用一種藥品，高濃度長時間抑菌會使微生物產生抗藥性。因此，將三種藥品加以組合用于蘭苗培養過程中的抑菌。實驗結果見下表。

表4 組合藥品抑菌圈測試

從上表可以看到，鏈霉素、慶大霉素、苯甲酸都是相同濃度組合效果優于表3中在相同濃度條件下單獨使用一種藥品的抑菌效果好。隨著濃度的增加，抑菌圈越大，但是考慮到過高藥品濃度會對蝴蝶蘭苗的生長造成影響，以及使微生物產生抗藥性，因此選擇中間濃度的藥品組合用于抑菌[5-7]。

2.3 抑菌劑對蝴蝶蘭瓶苗生長的影響

采用100mg/L和200mg/L的藥品添加到蝴蝶蘭增殖培養基中觀察對蝴蝶蘭苗生長的影響。發現200mg/L對蝴蝶蘭苗的生長影響較大，葉片生長緩慢，易黃化。而采用100mg/L的組合則沒有受到影響，結果見下表5。

表5 組合抗菌劑對接種90d蝴蝶蘭瓶苗生長的影響

3 結語

本實驗對蝴蝶蘭污染瓶苗中的污染微生物進行分離純化劑初步鑒定，得到常見污染物有6種，其中1號為球菌、2號為桿菌、3號為酵母菌、4號為木霉、5號為黑曲霉，6號為青霉菌。采用100mg/ L鏈霉素+100mg/L慶大霉素+100mg/L苯甲酸處理，可以得到非常好的抑菌效果，同時對蝴蝶蘭苗的增殖生長影響很小。

參考文獻：

[1]李娟.蝴蝶蘭再生體系的建立及組織培養中的污染防治研究[D].

[2]于福科, 張廣軍.玫瑰組織培養污染控制技術措施. 陜西農業科學, 2002(11):47-48.

[3]周俊輝, 周厚高, 劉花全.植物組織培養中的內生細菌污染問題[J].廣西植物, 2003,23(01):41-47.

[4]時群.紅掌組織培養污染率控制研究(簡報)[J].亞熱帶植物科學,2010(03):80-81.

[5]潭文澄.觀賞植物組織培養技術[M].北京：中國林業出版社,1991.

[6]謝鳳琦,張金蓮,董新玉.植物組織培養中常見病原菌種類及污染控制措施[J].林業科技，2014(02):182-183.

[7] 訾梅廷，徐連峰，李振海等.林木組織培養及工廠化育苗中污染的控制技術[J].防護林科技，2005(03):45-46.

項目支撐：2013年江蘇省大學生創新訓練計劃項目（編號：201311585004Y）

指導教師1：羅麗（1977-），女，副教授。

指導教師2：鄭霞（1977-），女，高級實驗師。

作者簡介：薄維超（1994-），男，漢族。連云港師范高等專科學校海洋港口學院12級學生。