m iRNA-221表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理分期的關系研究△

劉志英 徐虓 吳英杰

新疆醫科大學第五附屬醫院1病理科，2甲乳外科，3醫務部質管科，烏魯木齊830000

m iRNA-221表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理分期的關系研究△

劉志英1徐虓2吳英杰3#

新疆醫科大學第五附屬醫院1病理科，2甲乳外科，3醫務部質管科，烏魯木齊830000

目的 探討miRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及與臨床病理特征的關系。方法 選取甲狀腺乳頭狀癌（30例）、甲狀腺良性病變（25例）及正常甲狀腺組織（25例）共80例。采用real-time PCR法檢測m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織、良性病變組織及正常甲狀腺組織樣本中的表達，并分析m iRNA-221的表達與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的相關性。結果 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯高于甲狀腺良性病變組織和正常甲狀腺組織（P＜0.05）；miRNA-221的表達水平與甲狀腺乳頭狀癌組織的病理分級具有明顯的相關性（r=0.823，P＜0.05）。結論 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達升高，且與甲狀腺乳頭狀癌的組織病理分級相關，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌的發生發展中有重要作用。

miRNA-221；甲狀腺乳頭狀癌；病理

M ircroRNA（m iRNA，m iR）是一種由17～25個堿基組成的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于動物、植物體內。迄今已經在多種物種（包括果蠅、植物、人類等）中鑒別出超過3500種m iRNA分子。隨著對m iRNA的深入研究，發現m iRNA通過調控細胞信號分子來調節細胞的增殖、分化和凋亡[3]。miRNA在多種腫瘤中的表達異常都與腫瘤的發生發展、侵襲轉移及預后等密切相關。

miRNA-221是X染色體的相同基因簇編碼，是由其編碼基因轉錄生成的初級轉錄產物，在多種腫瘤中表達異常，如肝癌、甲狀腺癌、白血病和惡性膠質瘤等[4]。本研究檢測甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤組織中m iRNA-221的表達水平，分析其在甲狀腺乳頭狀癌發生發展中的作用，為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷和預后提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取自2013年2月至2014年2月就診新疆醫科大學第五附屬醫院的甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性病變及正常甲狀腺組織共80例。其中甲狀腺乳頭狀癌30例，包括男11例，女19例，年齡22～65歲，平均（43.2±10.8）歲；甲狀腺良性病變25例，其中男8例，女17例，年齡21～60歲，平均（40.2±11.1）歲；因咽喉部腫瘤手術切除的正常甲狀腺組織25例，其中男11例，女14例，平均（41.8± 10.1）歲。甲狀腺乳頭狀癌的分期按照2002年美國癌癥聯合會發布的標準[12]。手術中取樣本后立即放入液氮中保存，然后轉入－70℃冰箱長期保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑 RNA提取試劑Trizo（linvitrogen公司）；DNA Marker、PCR試劑盒（晶美生物工程）；hsa-miRNA-221引物（RiboBio公司）；β-actin（Sigma公司）；real-time PCR system（Applied Biosystems公司）、real-time PCR試劑盒（TakaRa公司）。

1.2.2 總RNA的提取 將組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入Trizol試劑1 m l充分混勻，提取組織中的總RNA。通過異丙醇沉淀濃縮RNA，使用分光光度計定量，使用1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質量。將提取的RNA保存于－80℃冰箱中備用。

1.2.3 反轉錄反應 按照反轉錄試劑盒的說明進行操作，RNA的量為0.5μg，冰上加入以下試劑：總RNA 1μl，5×Prime Script Buffer 5 m l，Prime Script RT Enzyme M ix 1μl，stem-loop RT primer 2 μl，并加入DEPC水至總體積為20μl。然后將反應管置入PCR反應儀中，反應條件為42℃反應15 m in、85℃反應5 s、4℃反應15m in，產物在－80℃冰箱中保存備用。

1.2.4 real-time PCR PCR反應體系如下：miR-221擴增片段長73 bp，其上游引物為5'-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3'，下游引物為5'-CTTTGGTGTTTGAGA TGTTTGG-3'。real-time PCR MasterM ix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA 2 μl，加DEPC水至20μl。將反應管置于real-time PCR反應儀中，反應條件為95℃預變性15min，再按95℃反應15 s，60℃反應1m in，擴增40個循環。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS17.0軟件進行分析。m iRNA-221在甲狀腺腫瘤組織及正常組織間的相對表達水平采用方差分析，采用Spearman等級相關分析m iRNA-221與臨床病理的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

real-time PCR結果發現m iRNA-221在30例甲狀腺乳頭狀癌患者中的表達為（12.26±2.21），在25例甲狀腺良性病變組織中的表達為（2.16±1.14），在25例正常對照組中的表達為（1.07±0.83），三者差異具有統計學意義（P＜0.05）。m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌與良性病變組織中的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）；甲狀腺乳頭狀癌與正常對照組織中m iRNA-221的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）；良性病變組織與正常組織比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 m iRNA-221的表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理間的關系

根據miRNA-221的表達差異并結合患者的臨床病理資料分析得出，m iRNA-221的表達情況主要與甲狀腺乳頭狀癌的TNM分期有關，甲狀腺乳頭狀癌分化程度越高，m iRNA-221的表達也越高，腫瘤的分化程度與m iRNA-221的表達呈正相關（r=0.823，P＜0.05），見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌分期與m iRNA-221表達水平的相關分析

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌的發病率占全身惡性腫瘤的1%，占甲狀腺結節的5%，但卻是內分泌系統常見的惡性腫瘤。資料顯示中國近20年來的甲狀腺乳頭狀癌發病率呈逐年上升的趨勢，由于其起病多而隱匿，不易發覺，因而早期診斷困難。近年來，隨著對miRNA與腫瘤關系研究的深入，目前已有大量的與甲狀腺乳頭狀癌相關的m iRNA被鑒定[5-6]。Pallante等[7]檢測了m iRNA在甲狀腺乳頭狀癌及正常甲狀腺組織中的表達譜，發現m iRNA在二者中的表達譜明顯不同，乳頭狀癌組織中m iRNA-221、m iRNA-222的表達明顯高于正常組織。He等[8]通過m iRNA芯片檢測20例甲狀腺乳頭癌組織和6例癌旁正常組織中m iRNA的表達，結果發現miRNA-221、m iRNA-222及miRNA-146在甲狀腺乳頭狀癌中的表達較正常組織高10～19倍[9]，與本研究的結果基本一致。本組的研究表明，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌患者中的表達高于甲狀腺良性病變組織和正常組織，且具有明顯差異；而甲狀腺良性病變組織與正常組織中的m iRNA-221表達水平無明顯差異。研究提示m iRNA-221可能與甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖與分化有密切關系。

Yip等[10]研究通過RT-PCR法檢測出在浸潤性甲狀腺乳頭狀癌中，m iR-221、m iR-146等多種因子的表達比在非浸潤性甲狀腺乳頭狀癌中的高，與本研究結果相似。本研究提示甲狀腺乳頭狀癌TNM分期越高，m iRNA-221的表達與甲狀腺乳頭狀癌的TNM分期呈正相關。表明m iRNA-221可能在甲狀腺乳頭狀癌的發展及惡化過程中發揮重要作用[11]。

綜上所述，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯增加，為甲狀腺癌潛在的特征性分子事件，在甲狀腺乳頭狀癌的發生發展中起重要作用，檢測m iRNA-221對甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷和臨床治療具有一定的指導意義。

［1］李曉靜,蔣玲,婁萍萍,等.甲狀腺癌臨床病理學特點的回顧性分析[J].中華內分泌代謝雜志,2013,29(12): 1010-1014.

［2］史琳,張安文,羅寧,等.細胞周期正性調控因子的異常表達與甲狀腺癌發生發展的關系[J].南方醫科大學學報,2013,33(7):1031-1035.

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［5］Zhou YL,Liu C,Dai XX,et al.Overexpression ofm iR-221 isassociated w ith aggressive clinicopathologic characteristicsand the BRAFmutation in papillary thyroid carcinomas[J].Med Oncol,2012,29(5):3360-3366.

［6］Yang Z,Yuan Z,Fan Y,et al.Integrated analyses ofm icroRNA andmRNA expression profiles in aggressive papillary thyroid carcinoma[J].Mol Med Rep,2013,8(5): 1353-1358.

［7］Pallante P,Battista S,Pierantoni GM,et al.Deregulation ofm icroRNA expression in thyroid neoplasias[J].NatRev Endocrinol,2014,10(2):88-101.

［8］He XX,Guo AY,Xu CR,et al.Bioinformatics analysis identifies m iR-221 as a core regulator in hepatocellular carcinoma and its silencing suppresses tumor properties [J].OncolRep,2014,2(3):1200-1210.

［9］Yip L,Kelly L,ShuaiY,etal.M icroRNA signature distinguishes the degree of aggressiveness of papillary thyroid carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2011,18(7):2035-2041.

［10］Yip Linwah,Lindsey Kelly,Shuai Yongli,etal.M icroRNA signature distinguishes the degree of aggressiveness of papillary thyroid carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2011, 18(7):2035-2041.

［11］DentelliP,Traversa M,Rosso A,etal.miR-221/222 control lum inal breast cancer tumor progression by regulating different targets[J].Cell Cycle,2014,13(11):1811-1826.

Theexpression ofm iR-221 in thyroid cancerand its relationshipw ith clincopathologicalstaging△

LIU Zhi-ying1XU Xiao2WU Ying-jie3#
1Departmentof Pathology,2Departmentof Thyroid and BreastSurgery,3MedicalDepartmentof Quality Control,the Fifth A ffiliated Hospitalof Xinjiang MedicalUniversity,Urumqi830000,Xinjiang,China

Objective To explore the m iRNA-221 expression in thyroid neoplasms and its clinical pathological features.Method A total of 80 cases of thyroid papillary carcinoma(30 cases),thyroid benign lesions(25 cases) and normal thyroid(25 cases)were included in this study.Real-time PCR was applied in detecting miRNA-221 expression in thyroid papillary carcinoma,benign lesions and normal thyroid tissue samples,besides,the correlation between m iRNA-221 expression and clinical pathological features of thyroid papillary carcinoma was analyzed.Result The real-time PCR showed that them iRNA-221 expression in thyroid papillary carcinoma tissue is significantly higher than that in either benign lesions or normal thyroid tissue(P＜0.05),and the expression levelwas significantly associated w ith pathological staging of thyroid papillary carcinoma(r=0.823,P＜0.05).Conclusion Them iRNA-221 expression is increased in thyroid papillary carcinoma tissues,and is correlated w ith the pathological staging of thyroid papillary carcinoma tissue,suggesting that the miRNA-221 is significantly engaged in the occurrence and development of thyroid papillary carcinoma.

m iRNA-221;thyroid papillary carcinoma;pathology

R736.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.05.17

Oncol Prog,2015,13(5)

甲狀腺癌是頭頸部最常見的腫瘤，也是常見 的內分泌惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的1%。其發病率近年來有逐漸升高的趨勢，特別是在2003年以后，每年以14.51%的速度增長，且發病年齡趨向年輕化。甲狀腺癌按病理類型可分為：乳頭狀癌和濾泡狀腺癌，其中乳頭狀癌占甲狀腺癌的60%～70%。目前，甲狀腺乳頭狀癌已經成為近20年來中國女性惡性腫瘤中發病率升高迅速的腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌早期臨床表現不明顯，發病機制也不明確，其診斷及預后缺乏特異性的生物學指標，因此，引起了廣大學者的深入研究[2]。

新疆醫科大學第五附屬醫院院級科研基金（WFY 2014013）；新疆醫科大學科研創新基金（校級，XJC201079）#

（corresponding author），e-mail：wyj9619@126.com

2015-04-29）