高脂及糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體中eNOS eNOS 和ET-1ET-1蛋白表達的研究*

張成梅 李一鋒 甘美舍 申樹林 鄭 程 李廣裕 梁季鴻廣西醫科大學第一附屬醫院男性科 （南寧 530021）

高脂及糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體中eNOS eNOS 和ET-1ET-1蛋白表達的研究*

張成梅 李一鋒 甘美舍 申樹林 鄭 程 李廣裕 梁季鴻**
廣西醫科大學第一附屬醫院男性科 （南寧 530021）

摘要目的 探討高脂及糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）和內皮素-1 （ET-1）蛋白表達的變化及其可能的機制。方法 58只SPF級雄性SD大鼠隨機分成3組：（1）對照組（n=14），普通飼料喂養；（2）高脂組（n=15），高脂飼料喂養24周后在原飼料配方中加入含0.2%硫氧嘧啶繼續喂養；（3）糖尿病組（n=29），高脂飼料喂養24周后腹腔注射20mg/kg STZ；于實驗開始后36周末，檢測大鼠血糖、血清總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、胰島素水平；成模后用阿樸嗎啡誘導并觀察大鼠陰莖勃起功能變化；采用 Western blot 檢測大鼠陰莖海綿體組織eNOS和ET-1蛋白表達。結果 血糖、胰島素、血脂檢測結果顯示成功建立了高脂和糖尿病模型。與對照組相比，高脂及糖尿病組大鼠勃起功能明顯下降， eNOS蛋白表達顯著降低，而ET-1顯著升高（P＜0.05）；與高脂組相比，糖尿病組eNOS與ET-1表達進一步失衡，且陰莖勃起功能障礙較高脂組加重。結論 糖尿病和高脂血癥導致勃起功能障礙的發病機制可能與陰莖海綿體組織內eNOS和ET-1表達失衡密切相關。

關鍵詞糖尿病; 高脂血癥; 一氧化氮合酶; 勃起功能障礙

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是一種男性常見病，發病率逐年上升。陰莖勃起的本質是一系列的神經血管活動。正常陰莖勃起很大程度上依賴于陰莖組織中足夠的舒血管物質及正常的平滑肌細胞舒縮狀態。血管舒張因子與收縮因子之間的平衡對平滑肌狀態有重要影響，其中，內皮素-1 （ET-1）與一氧化氮（NO）間的平衡可能起主要作用[1]。高脂血癥和糖尿病作為一種全身性、血管性的疾病，可導致各個器官的損害，陰莖的海綿體組織也不例外。ED的發生又往往早于其他伴有明顯內皮損傷的心血管疾病如全身動脈粥樣硬化，冠心病等，被認為是此類疾病的早期警報[2]。通過測量內皮細胞分泌物血濃度來了解內皮功能（NO/ET等）一般意義不大，因為這些物質的半衰期很短，除了血管內皮分泌外, 還可能為局部分泌[3]。目前，關于ED研究大多集中在檢測NO合成的關鍵酶各亞型的表達，單方面強調 NO作用。ET-1在大鼠陰莖海綿體組織的蛋白表達，及其與內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達變化跟大鼠ED之間的關系，目前報道仍然不多。

本研究通過建立大鼠高脂血癥和糖尿病動物模型，主要檢測大鼠勃起功能及陰莖海綿體eNOS 和ET-1蛋白的表達情況，揭示高脂血癥、糖尿病引起ED的發病機制。

材料與方法

一、動物

SPF級雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠58只，鼠齡10周，體質量250～300g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，4只/籠，自由飲水，環境溫度20～25℃，光照: 白天12h/夜晚12h，交替進行。進入研究前交配實驗證實均有正常的性功能（由與發情雌鼠交配證實）。

二、主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ, Sigma公司）；阿樸嗎啡（APO，Sigma公司）； 一抗（均購于abcam公司）：Rabbit polyclonal to eNOS；Mouse monoclonal TR.ET.48.5] to Endothelin 1；rabbit polyclonal to Actin Loading Control ；熒光二抗：IRDye 800CW goat nti-rabbit IgG(H+L)、IRDye 800CW goat anti-mouse gG(H+L) 、Odyssey雙色紅外熒光成像系統（ 美國I-COR 公司）；ACCU-CHEK?Advatage血糖儀及配套試紙； 日立7600全自動生化分析儀。

三、高脂模型及糖尿病模型建立

高脂飼料配方[4]：基礎飼料55%，豬油 15%，蔗糖15%，蛋黃10%，3%～5%食鹽和2%膽固醇，由北京飼料公司制作。實驗前對大鼠實驗性喂養1周。然后隨機分成3組：對照組、高脂組和糖尿病組。對照組（n=14）普通飼料喂養。高脂組（n=15）高脂飼料喂養24周后在原飼料配方中加入含0.2%硫氧嘧啶，繼續喂養。糖尿病組（n=29）高脂飼料喂養24周后禁食16h，再一次性腹腔注射STZ 20mg/kg，其他兩組大鼠腹腔內注射檸檬酸鈉緩沖液。STZ注射3d后，尾靜脈取血，血糖儀檢測，任意時間血糖濃度＞16.67 mmol/L為糖尿病造模成功。成模后每周測血糖一次，血糖不達標者則剔除[5]。最終篩選出15只大鼠為糖尿病大鼠。

四、勃起功能檢測

參考Heaton[6]的方法；實驗開始前將大鼠稱量后放入觀察籠中，適應環境10min，室內保持安靜，燈光調暗，僅夠觀察即可。稱取5mgAPO加入到125mL維生素C及生理鹽水溶液中，APO終濃度為40μg/mL，按80μg/100g于大鼠頸項皮膚松軟處，行皮下注射，注射完畢后立即將大鼠放入觀察籠中，啟動錄像設備（HDR-XR150E,SONY中國上海）觀察30min，記錄陰莖勃起次數，陰莖充血及末端陰莖體露出為勃起 1 次，并計算大鼠勃起率，即有陰莖勃起的大鼠數量占每組大鼠總數的百分比 。

五、動物處理

APO試驗結束后3d，大鼠禁食12～16h后，稱量，取尾靜脈血測空腹血糖（Fasting Blood glucose，FBG），大鼠麻醉后頸動脈取血，離心取血清， -20℃冰箱保存備用，迅速剪開下腹，分離出陰莖海綿體組織，取前段迅速固定于4%多聚甲醛溶液中，用于包埋切片，用于免疫組化檢測和馬森染色，取陰莖中后端放入凍存管，-80℃冰箱保存，用于Westorn blot檢測蛋白。

六、代謝指標測定

全自動生化分析儀測血清中總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平，放免法測空腹胰島素（Fasting insulin，FINS），計算穩態胰島素抵抗指數[7]（HOMA - IR index：空腹血糖FBG×空腹胰島素FINS/ 22.5）。

七、Western blot blot

定量分析各組eNOS和ET-1在陰莖組織的蛋白表達。取大鼠新鮮陰莖海綿體中后段組織約100mg，剪碎，液氮研磨加超聲粉碎 ，冰上裂解，提取總蛋白， Bradford 法測蛋白濃度，變性。eNOS、ET-1分別制備8%和12%十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠（SDS - PAGE），行電泳、轉膜、封閉非特異抗原，eNOS 加eNOS一抗（1:250）4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜后抗兔熒光二抗（1:10000）室溫孵育2 h；ET-1 加ET-1一抗（1:500）4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜后抗鼠熒光二抗（1:4000）室溫孵育 2 h。內參加兔抗鼠β-actin一抗（1:1000）4℃過夜及抗兔熒光二抗室溫孵育，再次洗膜后分別于Odyssey雙色紅外熒光成像系統進行掃膜， 采用Odyssey V3.0軟件分析，以目的蛋白/β-actin蛋白條帶吸光度值作為蛋白表達強度。

八、統計學分析

實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS16.0軟件進行分析處理，多組均數比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩組間比較，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、代謝指標

36周末，高脂組及糖尿病組大鼠的TC、LDL-C及胰島素水平明顯高于對照組（P＜0.05）；而糖尿病組TG表達水平跟對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），且高脂組TG水平低于糖尿病組和對照組（P＜0.05）；高脂組與糖尿病組HDL-C水平相似，兩者無統計學差異（P＞0.05），但都高于對照組（P＜0.05）； 高脂組血糖水平沒有升高，與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），而糖尿病組空腹血糖顯著高于高脂組和對照組 （P＜0.05）；3組大鼠的體質量對照組最高，高脂組次之，糖尿病組最低；而HOMA-IR趨勢與體質量相反，糖尿病組最高，高脂組次之，對照組最低，3組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），（表1）。

表1 3組代謝指標比較 （x±sxs）

二、勃起功能檢測

注射APO后，高脂組有3只大鼠能勃起，糖尿病組僅有1只勃起，而對照組大鼠均能勃起，可見糖尿病組和高脂組的大鼠的勃起率明顯降低（P＜0. 05）。與對照組相比，高脂組及糖尿病組陰莖勃起次數顯著降低（P＜0. 05）（表2）。

表2 大鼠陰莖勃起次數及勃起率（x±sxs）

三、eNOSeNOS和ET-1ET-1蛋白表達

在140KD和24KD附近分別檢測出eNOS和ET-1特異性條帶，以β-actin作為內參，采用Odyssey V3.0軟件定量分析eNOS和ET-1的蛋白表達：對照組、高脂組和糖尿病組eNOS蛋白表達分別為：0.3757± 0.0407、0.0491±0.0045和0.0327±0.0034。3組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），其中高脂組和糖尿病組eNOS蛋白表達明顯低于對照組，與高脂組相比，糖尿病組eNOS蛋白表達更低。ET-1蛋白表達趨勢與eNOS相反，在對照組、高脂組和糖尿病組分別為：0.5690±0.1587、1.1235±0.1834和1.3484± 0.2247。3組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），高脂組和糖尿病組ET-1蛋白表達明顯高于對照組，與高脂組相比，糖尿病組ET-1蛋白表達進一步升高，（圖1）。

討 論

糖尿病、高脂血癥與ED的關系已成共識，高脂血癥和糖尿病都是導致ED發生的重要危險因素，但是兩者誘發ED的機制十分復雜。研究報道發現[8]ET-1在1型和2型糖尿病性ED動物模型以及病人血漿中表達水平均明顯升高，提示其在ED發病中具有重要作用。

本實驗應用高脂喂養誘導高脂血癥模型及高脂喂養聯合小劑量STZ誘導糖尿病模型，在誘導36周后各代謝指標檢測結果顯示：高脂組雖有胰島素、TC 及LDL-C水平明顯上升，但血糖未見升高，出現明顯的高膽固醇血癥；糖尿病組血糖、胰島素、TC、LDL-C水平明顯高于對照組。本實驗高脂組大鼠出現嚴重的脂代謝紊亂并伴有胰島素抵抗，糖尿病組大鼠出現高血糖、高胰島素血癥、脂代謝紊亂，表明高脂血癥及糖尿病模型成功可靠；并通過阿樸嗎啡試驗成功篩選出高脂及糖尿病性ED模型。

圖1 western blot 檢測eeNNOOSS和EETT--11的蛋白表達

一般認為內皮型一氧化氮合酶（eNOS）在內皮細胞中持續合成釋放NO，在促使陰莖充勃起分并維持勃起狀態起到關鍵作用。而海綿體內皮和平滑肌細胞合成的ET-1通過自分泌或旁分泌作用于細胞膜上的ET-A 和ET-B 兩種受體，在維持脈管系統和海綿體平滑肌收縮張力，保持陰莖疲軟狀態中起主要作用[9]。 Azadzoi 等[10]證實高脂血癥及動脈粥樣硬化可降低NOS 活性，增加血管收縮物質的產生，降低髂內動脈血流量。脂代謝紊亂時，內皮細胞的損傷和局部大量聚集的炎性細胞成為超氧陰離子的重要來源，使NO合成減少，血管的收縮性增強，且脂質成分與超氧陰離子相互作用，其代謝產物加重內皮細胞的損傷。Chiou等[11]認為高血糖、脂代謝紊亂作用于海綿體內皮系統，使陰莖灌流不足，小血管乃至微血管的病變則引起海綿體缺血、缺氧，導致組織內大量的活性氧（ROS）產生，最終導致內皮系統受到損害，NOS表達減少，內皮依賴性NO合成和釋放減少。此外，在糖尿病兔海綿體內發現ET-1 及其受體表達增多。在本實驗中，我們對eNOS和ET-1蛋白表達的檢測發現：高脂組大鼠陰莖海綿體eNOS表達顯著降低而ET-1表達升高（P＜0.05）。這提示高脂血癥的代謝紊亂能導致大鼠陰莖海綿體eNOS表達下降以及海綿體血管內皮ET-1表達升高，兩者的失衡導致內皮功能障礙引起血管舒縮異常，從而影響勃起功能。

此外，本實驗還發現在高脂血癥的基礎上并發高血糖癥可導致大鼠陰莖勃起次數進一步降低（P＜0.05），且陰莖勃起率亦低于單純高脂血癥模型，該結果提示在高脂血癥基礎上并發高血糖癥可導致ED進一步加重。研究發現高血糖癥可增加ROS的生成，ROS可降低NO生物活性, 減少細胞內四氫葉酸的水平，并通過 eNOS 產生過氧酸鹽，ROS還可以激活PKC -α、PKC-β和PKC-δ，導致eNOS表達水平降低，并可增加內皮細胞中ET-1的表達，從而導致血管內皮功能障礙[12, 13]。Quehenberger等[14]研究表明高糖環境中 晚期糖基化終末產物（AGEs）與其受體RAGE的結合激活核轉錄因子-κB（NF-κB）的表達，可引起NF-κB依賴性的ET-1高表達。我們的研究結果顯示，糖尿病組eNOS蛋白表達低于高脂組，而ET-1蛋白表達則高于高脂組，這一發現提示高脂血癥基礎上并發高血糖癥所導致的ED加重的機制與eNOS和ET-1的表達進一步失衡密切相關。

綜上所述，糖尿病和高脂血癥與ED關系密切，糖尿病和高血脂癥通過高血糖、脂質紊亂等因素使調節血管張力的血管舒張因子和血管收縮之間的平衡被打破，在大鼠陰莖組織中主要表現為eNOS表達下降和ET-1表達升高，兩者的失衡導致內皮功能障礙，引起血管舒縮功能異常，從而導致ED。

參 考 文 獻

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2 Miner MM, Kuritzky L. Erectile dysfunction: a sentinel marker for cardiovascular disease in primary care. Cleve Clin J Med 2007; 74 Suppl 3: S30-S37

3 朱郇榮, 孫祥宙, 黃燕平, 等. 勃起功能障礙與血管內皮功能相關性研究及其影響因素. 北京大學學報?醫學版2010; 42(4): 418-420

4 劉莉, 蘆曄, 許峰銳. 大豆異黃酮對膳食誘導型代謝綜合征大鼠糖脂代謝、血清瘦素及FFA的影響. 中醫藥學報 2012; 40(5): 85-87

5 程晨, 林英立, 陳業剛, 等. 大鼠糖尿病性勃起功能障礙模型的實驗研究. 中國男科學雜志 2010; 24 (8): 33-35, 41 6 Heaton JP, Varrin SJ, Morales A. The characterization of a bio-assay of erectile function in a rat model. J Urol 1991; 145(5): 1099-1102

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8 Disanto ME. Contractile mechanisms in diabetes-related erectile dysfunction. Curr Pharm Des 2005; 11(31): 3995-4010

9 付衛華, 鄢俊安. 參與陰莖勃起的外周遞質信號通路及其與ED發生的關系. 重慶醫學 2010; 39(20): 2787-2789

10 Azadzoi KM, Goldstein I, Siroky MB, et al. Mechanisms of ischemia-induced cavernosal smooth muscle relaxation impairment in a rabbit model of vasculogenic erectile dysfunction. J Urol 1998; 160 (6 Pt 1): 2216-2222

11 Chiou WF, Liu HK, Juan CW. Abnormal protein expression in the corpus cavernosum impairs erectile function in type 2 diabetes. BJU Int 2010; 105(5): 674-680

12 Triggle CR, Ding H. A review of endothelial dysfunction in diabetes: a focus on the contribution of a dysfunctional eNOS. J Am Soc Hypertens 2010; 4(3): 102-115

13 Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 2005; 54(6): 1615-1625

14 Quehenberger P, Bierhaus A, Fasching P, et al. Endothelin 1 transcription is controlled by nuclear factor-kappaB in AGE-stimulated cultured endothelial cells. Diabetes 2000; 49(9): 1561-1570

（2014-12-08收稿）

**通訊作者, E-mail: jihongliang@126.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.004

中圖分類號R 587.1; R 698.1

*基金項目資助: 國家自然科學基金配套經費資助（項目編號：81260123)

Protein expression of eNOS and ET-1 in the corpus cavernosum of erectile dysfunction rat with hyperlipidaemia and diabetes＊

Zhang Chengmei, Li Yifeng, Gan Meishe, Shen Shulin, Zheng Cheng, Li GuangYu, Liang Jihong**Department of Andrology, the First Affi liated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China Corresponding author: Liang Jihong, E-mail: jihongliang@126.com

AbstractObjective To study the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and endothelin 1 (ET-1) in the corpus cavernosum of erectile dysfunction rat with hyperlipidemia and diabetes and explore its mechanism. Methodsthods Total of 58 male SD rats were randomly divided into three groups including the control group (n=14), high-fat group(n=15)and diabetes group (n=29). The rats in the control group were fed with normal feed, the rats in high-fat group and diabetes group were fed with lipid rich food for 24 weeks, and then the formor were given with 0.2% oxygen pyrimidine lipid rich food to keep feeding , while the later given with 20 mg/kgSTZ by intraperitoneal injection. Thirty-six weeks later, levels of fasting blood glucose, serum TG, TC, LDL-C, HDL-C and fasting insulin levels were measured respectively; The spontaneous erectile response induced by APO was observed; The expression of eNOS and ET-1 in corpus cavernosum tissue were detected by western blot. Resultssults The results of fasting blood glucose, fasting insulin and blood lipid showed that the rat models with hyperlipidemia and diabetes were established successfully; Compared with that of the control rats, erectile function and the expression of eNOS decreased remarkably, whereas the expression of ET-1 was incresed signifi cantly(P all<0.05) in high fat and diabetes group. Compared with that of high-fat group, the imbalance of eNOS and ET-1 and the erectile dysfunction were more severe in diabetes group. Conclusionusion The pathogenesis of diabetes and hyperlipidemia induced erectile dysfunction may be closely related to imbalance expression of eNOS and ET-1 in corpus cavernosum tissues.

Key wordsords diabetes mellitus; hyperlipidemias; nitric oxide synthase; erectile dysfunction