發酵方竹筍對復方地芬諾酯誘導小鼠便秘的預防效果

李貴節,王 存,況 剛,陳紹成,熊政委,趙 欣,6,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067;3.重慶市功能性食品工程實驗室，重慶第二師范學院，重慶 400067；4.重慶市功能性食品協同創新中心，重慶第二師范學院，重慶 400067；5.重慶市功能性食品工程技術中心，重慶第二師范學院，重慶 400067；6.重慶第二師范學院 功能性生態食品研究所,重慶 400067)

發酵方竹筍對復方地芬諾酯誘導小鼠便秘的預防效果

李貴節1,2,3,4,5,6,王 存2,3,4,5,況 剛2,3,4,5,陳紹成2,3,4,5,熊政委2,3,4,5,趙 欣2,3,4,5,6,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067;3.重慶市功能性食品工程實驗室，重慶第二師范學院，重慶 400067；4.重慶市功能性食品協同創新中心，重慶第二師范學院，重慶 400067；5.重慶市功能性食品工程技術中心，重慶第二師范學院，重慶 400067；6.重慶第二師范學院 功能性生態食品研究所,重慶 400067)

本研究就發酵方竹筍對復方地芬諾酯誘導小鼠便秘的預防效果進行了研究。對發酵方竹筍纖維的觀察發現發酵方竹筍比未發酵方竹筍具有更疏松的纖維組織結構,有利于緩解便秘。飼喂發酵方竹筍9 d的便秘小鼠排出首粒黑便的時間低于對照組和方竹筍喂養組,高于正常組和比沙可啶藥物治療組;活性炭在發酵方竹筍喂養組小鼠小腸中推進率高于對照組和方竹筍喂養組,低于正常組和比沙可啶藥物治療組。通過HE切片也觀察到,發酵方竹筍可以降低便秘對小腸造成的損傷,減少小腸絨毛的斷裂,效果優于未發酵方竹筍。同時發酵方竹筍較對照組可以顯著升高小鼠血清中的胃動素(MTL)、內皮素-1(ET-1)、血管活性腸肽(VIP)和乙酰膽堿酯酶(AchE)水平。由此可見,發酵方竹筍具有較好的便秘預防效果。

方竹筍,發酵,便秘,地芬諾酯

方竹(Chimonobambusaquadrangularis(Fenzi)Makino),禾本科竹亞科寒竹屬植物[1],主產于我國渝黔地區高海拔的叢林中,其竹筍是無污染的天然優質食品[2]。方竹筍一般在秋季成熟,其出產時間與大多數竹筍不同,從而具有特殊的品質。方竹筍營養成分豐富,含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素C、維生素B族和鈣、磷、鐵、鋅、硒等礦物質元素,此外還含有豐富的纖維素[3]。發酵可以提高食品原有的品質,包括改善口味、增加營養成分和改善營養素比例等;利用微生物發酵可改善竹筍中膳食纖維的生理功能[4]。

在現代社會中,便秘是一種常發的生理狀態,出現便秘狀態的人群排便次數下降且由于糞便的水分含量下降導致單次排便量下降和排便困難[5]。由于工作狀態等的影響,現代人群中有約70%的人處于亞健康狀態,處于亞健康狀態的人群多有腸胃不適的表現,這其中又有相當多的人群處于便秘狀態。食用包括保健食品在內的具有改善身體狀態和機能的食品可以使亞健康狀態人群恢復正常,而通過食品改善便秘狀態正是當今提倡的改善腸道健康的重要方式[6]。竹筍中的纖維已經被證實具有很好的抑制便秘的作用[7],有研究報導經發酵后竹筍中的膳食纖維可以獲得改善,經過發酵的竹筍對便秘的作用得到了提高[8]。

復方地芬諾酯是一種治療功能性腹瀉的藥物,可以阻滯腸粘膜上的受體,減輕腸道蠕動使腸內容物通過發生延遲,正常狀態下服用可導致便秘[9],利用復方地芬諾酯的這個藥理作用,采用其誘導小鼠便秘建立動物便秘模型已經成為檢驗食品抑制便秘效果的重要實驗手段[10]。本研究利用復方地芬諾酯片誘導小鼠產生便秘狀態,觀察發酵方竹筍對復方地芬諾酯片誘導便秘的預防作用,對采用發酵方式對方竹筍的進一步開發利用提供了新的理論支持,為發酵方竹筍開發成胃腸道功能性食品提供了基礎的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮方竹筍 由重慶雪瑞盛泉農業開發有限公司提供。復方地芬諾酯片 國藥準字H32022716常州康普藥業有限公司;比沙可啶 美國Sigma公司;小鼠胃動素(MTL)、內皮素-1(ET-1)、血管活性腸肽(VIP)ELISA Kit 武漢華美生物工程有限公司;小鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒 南京建成生物工程研究所;其余試劑均為國產分析純。

嗜酸乳桿菌LA2和乳鏈球菌LS3分離自新鮮方竹筍殼。

SPF級6周齡雌性昆明小鼠100只 動物許可證號:SCXK(渝)2012-0001,購自于重慶醫科大學動物實驗中心。

FA2004電子分析天平 上海奕宇電子科技有限公司;SKY-IIIC恒溫培養振蕩器 上海蘇坤實業有限公司;FW177高效粉碎機 重慶邁克科技公司;DHG-9202-2SA恒溫干燥箱 常州一諾儀器制造有限公司;UV-1750型紫外分光光度計 日本島津公司;Y-2A生物研究顯微鏡 日本尼康公司;TG1650-WS高速離心機 重慶春鑫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵方竹筍 將培養好的嗜酸乳桿菌LA2和乳鏈球菌LS3分別以4000 r/min離心10 min,棄上清培養基,再用適量無菌生理鹽水洗滌一次,最后用生理鹽水重懸,調整菌液的濃度為7.5×109cfu/mL,植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌液按1∶1比例混合制成方竹筍發酵菌液。取鮮方竹筍5 kg洗凈后適度破碎,加入500 mL混合發酵菌液在42 ℃下主發酵16 h,4 ℃下后發酵12 h,制成發酵方竹筍。

1.2.2 竹筍纖維顯微鏡觀察 將新鮮方竹筍和發酵方竹筍用粉碎機粉碎后,用10倍質量生理鹽水清洗3次,棄去液體后加入10倍質量95%乙醇清洗殘留物,以1000 r/min離心5 min,棄去上層液體。將洗凈固體取小塊壓片并滴3滴亞甲基藍1%乙醇溶液染色,制成方竹筍纖維玻片標本,在顯微鏡下放大20×5倍觀察。

1.2.3 竹筍飼料制作 將新鮮方竹筍和發酵方竹筍巴氏滅菌后烘干,然后將烘干后的方竹筍和發酵方竹筍粉碎,按重量比1∶9分別與小鼠飼料混合并壓制成型,得到含10%新鮮方竹筍和發酵方竹筍的實驗小鼠飼料。

1.2.4 小鼠便秘實驗 將實驗小鼠隨機分為正常組、對照組、比沙可啶治療組、方竹筍喂養組和發酵方竹筍喂養組,每組10只。正常組小鼠實驗過程中不進行任何處理;對照組小鼠在實驗的前6 d不進行任何處理,6 d后每天給小鼠灌胃復方地芬諾酯懸液(5 mg/kg)一次,連續灌胃3 d;比沙可啶治療組小鼠在實驗過程中每天給小鼠灌胃比沙可啶(100 mg/kg)一次,同時在6d后除繼續灌胃比沙可啶外每天還給小鼠灌胃復方地芬諾酯懸液(5 mg/kg)一次,連續灌胃3 d;在實驗過程中以上三組小鼠均給予自由攝入飲水和普通小鼠飼料。方竹筍喂養組和發酵方竹筍喂養組小鼠在實驗過程中分別給予小鼠含10%方竹筍和10%發酵方竹筍的飼料,同時小鼠給予自由攝入飲水,在實驗的后3 d每天灌胃一次復方地芬諾酯懸液(5 mg/kg)。所有小組小鼠在實驗進行9 d后給予絕食24 h,然后給所有小鼠按濃度0.1 mL/10 g灌胃含10%活性炭冰水。各組10只小鼠平均分為兩部分,5只小鼠觀察排出首粒黑便的時間,5只小鼠灌胃活性炭冰水30 min后斷頸處死后觀察活性炭在小腸中的推進率,推進率(%)=活性炭在小腸中推進距離/小腸總長度×100[11-12]。

1.2.5 血清指標檢測 小鼠血液在4500 r/min轉速下離心10 min,吸取上層清液獲得小鼠血清,按照小鼠胃動素(MTL)、內皮素-1(ET-1)、血管活性腸肽(VIP)和乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒說明書測定小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE指標。

1.2.6 小鼠小腸病理學觀察 小鼠解剖后取小腸放入10%福爾馬林溶液中固定24 h,將小腸組織放入95%的乙醇中脫水后放入二甲苯中以替換出組織塊中的酒精使小腸組織透明化,然后將已透明的組織塊置于溶化的石蠟中浸蠟包埋,通過切片機切片后用蘇木精-伊紅(HE)染色后制成小鼠小腸病理切片,在顯微鏡下放大10×5倍觀察[13]。

1.3 數據統計

對各項實驗重復進行3次,實驗結果使用SAS統計軟件對所得數據采用one-way ANOVA法分析數據結果在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 發酵方竹筍與新鮮方竹筍纖維的顯微形態觀察

由圖1可以看到發酵后的方竹筍的纖維較新鮮方竹筍空隙增大,顯得更為松弛,新鮮方竹筍纖維緊湊致密,纖維之間的空隙較小。發酵后的方竹筍纖維間隙增大,使水分更容易進入纖維間,增大了竹筍纖維的吸水性和持水力,使纖維素更好的吸收水分膨脹,增加糞便的體積,增強對腸壁的刺激,促進腸蠕動[14];同時使糞便保持更多的水分,防止糞便干燥,有利于排便。有研究也表明發酵可以大大提升竹筍的持水力,與本研究得到了相似的結果[8]。由此可見,發酵對方竹筍纖維產生的作用更有利于排便,可以有效的緩解便秘。

圖1 發酵方竹筍與新鮮方竹筍纖維的形態觀察(20×5)Fig.1 Morphologic observation of fibers offermented Chimonobambusa quadrangularis shoot andfresh Chimonobambusa quadrangularis shoot(20×5)

2.2 發酵方竹筍與新鮮方竹筍對小鼠首粒黑便排除時間的影響

對絕食24 h小鼠灌胃活性炭水后觀察小鼠排出黑便的時間。結果顯示,正常組小鼠排出首粒黑便所需時間最短,為62 min(圖2);對照組小鼠排出首粒黑便所需時間最長,達到171 min。比沙可啶作為臨床上治療便秘的有效藥物,在本研究中作為治療對照灌胃小鼠,該組小鼠首粒黑便排除時間較對照組大幅度下降(82 min);方竹筍對小鼠(未發酵方竹筍喂養組)排出黑便具有一定的促進作用,使排出黑便的時間減少到117 min;發酵后的方竹筍(發酵方竹筍喂養組)使排出首粒黑便的時間進一步下降,接近藥物比沙可啶組小鼠,僅為93 min。便秘患者排便困難,排便的頻率較正常人低,小鼠便秘模型模擬人便秘狀態,在排便困難的狀態下排出由活性炭水產生的黑便的時間可以作為衡量便秘程度的標準[15]。方竹筍中豐富的膳食纖維可以增強腸道的蠕動,促進腸道內容物通過腸道,減少內容物在腸道中滯留時間,發酵后的方竹筍持水性更好,更有利于腸道的蠕動[14],加速內容物的排出,有利于黑便的排出。結果顯示食用發酵方竹筍飼料的小鼠的排出黑便的時間顯著低于食用方竹筍的小鼠(p<0.05),發酵方竹筍更有利于促進腸道健康,便于排便。

圖2 灌胃活性炭水后小鼠排除首粒黑便時間Fig.2 First black stool defecation time ofmice after treating with activated carbon water by gavage注:不同字母表示各組數據平均值具有顯著差異(p<0.05)。

2.3 發酵方竹筍與新鮮方竹筍對小鼠糞便的影響

對小鼠誘導便秘后收集各組小鼠每日的糞便,觀察便秘對小鼠排便的影響(圖3)。由小鼠的糞便狀態可以看出正常組小鼠的排便量最大;對照組小鼠的排便量最少;比沙可啶治療組小鼠的排便量與正常組相近;方竹筍喂養組和發酵方竹筍喂養組小鼠的排便量低于正常組,但大大高于對照組,且發酵方竹筍喂養組的排便量大于方竹筍喂養組。同時正常組、比沙可啶治療組、發酵方竹筍喂養組小鼠排出的糞便顆粒要大于對照組和方竹筍喂養組。便秘對身體造成的最明顯表現就是排便困難,排出的糞便量少且由于水分含量低導致顆粒干蔫[5],由觀察實驗小鼠的糞便可以看出復方地芬諾酯誘導便秘后對照組小鼠的排便量大大下降,比沙可啶明顯的緩解了排便量下降的情況,方竹筍和發酵方竹筍也能起到緩解便秘增大排便的效果,且發酵方竹筍的效果更為優異,明顯高于未發酵的普通方竹筍。可見方竹筍是一種很好的緩解便秘的食品,并且發酵可以使其對便秘的緩解作用得到提高。

圖3 誘導便秘后小鼠糞便狀態Fig.3 Dejection states of mice after inducing constipation

2.4 發酵方竹筍與新鮮方竹筍對活性炭推進率的影響

由圖4和表1可以看出活性炭水在正常組小鼠小腸中的推進距離(50.3 cm)和推進率(96.5%)最高,顯著高于其他各組小鼠(p<0.05)。對照組小鼠由于誘導便秘,活性炭在小腸中的推進距離(16.7 cm)和推進率(32.2%)最低。比沙可啶治療組小鼠由于藥物的治療,便秘得到緩解,活性炭的推進距離和推進率較對照組大幅度提高,略低于正常組。活性炭在方竹筍和發酵方竹筍喂養組小鼠小腸的推進較對照組也有較大提高,推進距離和推進率都大于對照組,低于正常組和比沙可啶治療組(p<0.05),且發酵方竹筍喂養組小鼠小腸中的活性炭比方竹筍喂養組推進得更多,推進率更高。活性炭在小腸中的推進距離和推進率是衡量小腸功能的重要指標,可以判斷小鼠的便秘程度,推進距離越長,推進率越高意味便秘的程度更低[15]。從小鼠排出首粒黑便的時間可以看出,由于方竹筍的作用,活性炭黑便在腸道中滯留時間減少,更快速的通過小腸;發酵后的方竹筍效果更為明顯,使活性炭盡量多的通過小腸。由此可見,本研究中便秘模型建立后小鼠小腸的活力差異明顯,活性炭在正常組和對照組中推進具有顯著差異(p<0.05),方竹筍可以顯著緩解便秘,使活性炭在小腸中的推進大幅度提高,且發酵后的方竹筍具備比未發酵的方竹筍更好的緩解便秘效果。

表1 發酵方竹筍對活性炭水在便秘小鼠小腸中的推進效果

注:同行不同字母表示各組數據平均值具有顯著差異(p<0.05)，表2同。

圖4 活性炭在便秘小鼠小腸中的推進情況Fig.4 Propel state of activated carbonin small intestine of constipation mice Small intestineof activated carbon-induced constipation mice

2.5 發酵方竹筍與新鮮方竹筍對小鼠小腸的影響

由圖5可以看到正常組小鼠的小腸壁厚度正常,小腸絨毛整齊;對照組小鼠的小腸壁不同的位置厚度不一,小腸絨毛大部分出現斷裂變短的現象。比沙可啶治療組小鼠的小腸壁厚度出現輕微的變化,個別位置出現厚度不均衡,但是小腸絨毛沒有出現斷裂的現象,整體與正常組小鼠相似。方竹筍喂養組小鼠的小腸壁厚度也出現不均一的情況,相當部分小腸絨毛也出現的斷裂;發酵方竹筍喂養組小鼠較方竹筍喂養組僅有小部分小腸絨毛發生的斷裂,小腸腸壁厚度接近正常組和比沙可啶治療組。便秘會導致小腸內壁受到一定的損傷,包括小腸絨毛變短和斷裂,影響正常的吸收和排便[13]。活性炭在小腸中滯留的時間越長,碳粒對腸道的影響越大,碳粒隨著小腸的蠕動對腸壁造成損傷加大,使更多的小腸絨毛斷裂。從整體上看,便秘對小鼠小腸有較大影響,小腸壁的厚度出現不均一狀態且小腸絨毛發生斷裂,而發酵方竹筍能得到接近比沙可啶減輕便秘對小腸影響的效果,使活性炭通過小腸時間減少,減輕碳粒對小腸絨毛的影響,其作用明顯優于新鮮方竹筍。

2.6 發酵方竹筍與新鮮方竹筍對小鼠血清指標的影響

圖5 小鼠小腸的形態觀察(10×5)Fig.5 Morphologic observation of mice small intestine(10×5)

由表2可以觀察到正常組小鼠血清中的MTL、ET-1、VIP和AchE水平顯著高于其他各組(p<0.05),對照組小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE水平最低。比沙可啶治療組、發酵方竹筍喂養組和方竹筍喂養組小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE的血清水平依次降低,都低于正常組高于對照組。胃動素(MTL)是一種能夠刺激分泌胃蛋白酶和促進腸道蠕動的胃腸激素,能夠有利于腸道的正常生理活動和促進排便[16]。內皮素可以保持血管的張力和保持心血管系統正常,避免便秘造成的其他疾病,內皮素-1(ET-1)是調節心血管功能的重要因子,具有促進血管正常的收縮與舒張、緩解便秘造成的血管收縮不正常等作用[17]。血管活性腸肽(VIP)具有平滑肌松弛和舒張血管的作用,還能增加小腸分泌液的產生和刺激腸道的蠕動,VIP的分泌減少可以直接導致便秘[18]。乙酰膽堿酯酶(AchE)對調整腸道收縮和促進粘液的分泌都有重要的作用,通過增強腸道收縮和腸道內粘液的分泌能使糞便更容易排出,避免便秘[19]。小鼠血清中的MTL、ET-1、VIP和AchE水平會隨著便秘程度的增強而降低,本實驗中發酵方竹筍較對照組可以顯著升高MTL、ET-1、VIP和AchE水平[15],且升高的幅度也大于未發酵的新鮮方竹筍,可見發酵方竹筍對緩解便秘具有很好的效果。

表2 實驗小鼠胃動素(MTL)、內皮素-1(ET-1)、血管活性腸肽(VIP)和乙酰膽堿酯酶(AchE)血清水平

3 結論

本研究通過復方地芬諾酯誘導小鼠產生便秘,建立小鼠便秘模型來檢測發酵方竹筍對便秘的預防作用。小鼠通過攝取含有發酵方竹筍的飼料模擬人體食用方竹筍的過程,使發酵方竹筍在小鼠體內發揮作用。觀察活性炭在小鼠體內作用發現,食用發酵方竹筍飼料的小鼠排出黑便的時間小于對照組小鼠和食用方竹筍飼料的小鼠,略高于正常小鼠和比沙可啶處理小鼠;活性炭在食用發酵方竹筍飼料的小鼠小腸中的推進率也得到了相似的結果,低于正常小鼠,高于對照小鼠和方竹筍喂養小鼠。通過HE切片觀察到便秘可以使小腸受到損傷、小腸壁和小腸絨毛形態受到顯著影響;發酵方竹筍可以明顯緩解和降低便秘造成的不良影響。通過檢測小鼠血清中的胃動素(MTL)、內皮素-1(ET-1)、血管活性腸肽(VIP)和乙酰膽堿酯酶(AchE)水平也發現,發酵方竹筍相對對照組可以顯著升高以上指標,使上述血清指標接近正常組小鼠。對發酵方竹筍纖維的進一步研究發現發酵過程可以改善方竹筍的纖維結構,使纖維有更好的緩解便秘效果。由以上結果可以得出發酵方竹筍可以提高方竹筍原有的便秘預防效果,是一種優質的緩解便秘的發酵食品。

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Preventive effect of fermentedChimonobambusaquadrangularisshoot on diphenoxylate induced constipation

LI Gui-jie1,2,3,4,5,6,WANG Cun2,3,4,5,KUANG Gang2,3,4,5,CHEN Shao-cheng2,3,4,5,XIONG Zheng-wei2,3,4,5,ZHAO Xin2,3,4,5,6,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;3.Chongqing Engineering Laboratory of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;4.Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;5.Chongqing Collaborative Innovation Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;6.Institute of Functional Ecological Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

This study was to determine the preventive effect of fermentedChimonobambusaquadrangularisshoot(FCQS)on diphenoxylate induced constipation in mice. The FCQS had more loosened fiber tissue structure than unfermentedChimonobambusaquadrangularisshoot(UCQS),which was more helpful to relieve constipation. After the mice were fed with FCQS for 9 days,the time consumption for their first black stool defecation was shorter than the control group and UCQS groups but longer than normal group and bisacodyl treatment group. The gastrointestinal transit of FCQS group was higher than control group and UCQS group,but lower than normal group and bisacodyl group. By observing the HE section of mice intestine,it was found that FCQS reduced the injury of intestinal tract suffering from constipation and alleviated the damages of the intestinal villi which were better than UCQS played. FCQS also can increase the serum levels of MTL(motilin),ET-1(endothelin-1),VIP(vasoactive intestinal peptide)and AchE(acetylcholinesterase)comparing with the control group. These results showed that FCQS had good preventive effect on constipation.

Chimonobambusaquadrangularisshoot;fermentation;constipation

2014-11-24

李貴節(1983-)，男，碩士，副教授，研究方向:功能性食品及食品營養與安全，E-mail:ligj@cque.edu.cn。

*通訊作者:趙欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：功能性食品及食品營養與安全，E-mail：foods@live.cn。

重慶市教委科學技術研究項目(KJ1401411)；重慶第二師范學院創新團隊計劃(KYC-cxtd03-20141002)；重慶高校創新團隊建設計劃資助項目( KJTD201325)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0357-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.067