響應(yīng)面法優(yōu)化β-乳球蛋白粗提物自組裝VE的工藝條件

劉艷玲，曹玉林，束天鋒，解倩倩，吳林昊，胡琪琳，薛秀恒，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036)

VE又名生育酚，是脂溶性維生素，具有較強的清除自由基作用，在體內(nèi)外都具有很好的抗氧化作用。同時，VE具有一定的抗衰老、抗癌功能作用，同時還具有延長保存期等［1－2］。但是由于VE是脂溶性物質(zhì)不溶于水，同時紫外線、堿和氧都能迅速破壞VE，使其難以在食品工業(yè)中很好的應(yīng)用［3－4］。因此，有必要使用特殊的方法對其進行處理，使VE既能保持其固有特性，又能彌補其易氧化和不易用于水溶性產(chǎn)品等不足之處。

食品中脂肪含量的降低，某些脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)隨之流失，為了保持脂溶性營養(yǎng)物價值，可以通過以改性乳清蛋白為基質(zhì)的脂肪替代品來強化某些脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)［5－6］。β－Lg 是乳清蛋白的主要成分，占乳清蛋白的50%［7］，是脂質(zhì)載體蛋白家族中的一員，β－Lg作為脂質(zhì)運載蛋白家族的成員，能結(jié)合小分子量的疏水性分子，對大量的疏水和兩性化合物具有親合力。研究表明，β－Lg具有三個潛在的配體結(jié)合位點，即β－折疊的空穴、β－折疊與α－折疊之間的凹槽內(nèi)的疏水性口袋表面，以及接近Trp19－Arg124的外側(cè)表面。目前已經(jīng)有了β－Lg成功結(jié)合物質(zhì)的例子，如 VA、VD、十八碳四烯酸、ω－3聚不飽和脂肪酸等［8－11］，但有關(guān) β－Lg 結(jié)合 VE方法的研究一直未見報道。本文利用磁力熱激作用以β－Lg粗提物作為VE的載體，制備 β－Lg－VE自組裝分子，采用 Box－Behnken 中心組合設(shè)計，利用響應(yīng)面分析法［12－14］建立并優(yōu)化了β－Lg粗提物結(jié)合VE工藝。研究結(jié)果對于VE在食品、飲料、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。β－Lg與VE均為益于健康的成分，因此該研究具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

35%脫鹽乳清粉 珠海市澳誠貿(mào)易有限公司;VE國藥集團化學(xué)試劑有限公司;透析袋 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純 上海振興化工一廠;實驗用水均為純水。

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;ZD－85氣浴恒溫振蕩器江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超生儀器有限公司;DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力作用器 鞏義市予華儀器有限責任公司;Allegra－64R離心機 合肥華澤生物技術(shù)有限公司;TGL－16G離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;CP224C電子天平 奧豪斯儀(上海)有限公司;FD－1CE型真空冷凍干燥機 北京天佑科技發(fā)展有限公司;QL－901渦旋混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 VE標準溶液的配制 精確稱取0.1 g VE于50 mL小燒杯中，用20 mL無水乙醇溶解，于紫外可見分光光度計掃描，其最大吸收波長為285 nm。進一步稀釋得到濃度為 1、2、3、4、5 mg/mL 的標準溶液，用無水乙醇作為空白對照，在285 nm波長處測定吸光度，測定三次，取其平均值。以吸光值(A)對濃度(C)作回歸計算，繪制標準曲線。

1.2.2 結(jié)合分子中VE的測定 準確稱取結(jié)合物0.2 g，加入1 mL純水充分溶解，然后加入 10 mL乙醇放入振蕩器中200 r/min振蕩提取20 min，用無水硫酸鈉除去水分。將溶液離心(3000r/min，10 min)，然后吸取上清液，以乙醇為空白，在285 nm測定吸光值［16］。

式中:C－樣品濃度(mg/mL);A－樣品的吸光值;B－稀釋倍數(shù);V－提取液體積(mL)。

1.2.3 β－Lg粗提物的制備 稱取43.6 g硫酸銨于100 mL純水中，用玻璃棒作用使其溶解，再加入7 g乳清粉，緩慢作用使其溶解。靜置0.5 h，離心分離(2000 r/min，15 min)，收集上清液用于下步分離［15］。用截留分子量為3500 u的透析袋近一步分離。最后將透析后的液體用真空冷凍干燥機干燥成粉末用于實驗。

1.2.4 β－Lg粗提物結(jié)合VE產(chǎn)物的制備 稱取一定質(zhì)量比例的β－Lg粗提物和VE，加入20 mL純水，渦旋混合30s，混合液在一定溫度下的磁力作用條件下反應(yīng)一段時間，迅速放入冰水浴中冷卻，得到反應(yīng)溶液。將反應(yīng)溶液放于截留分子量為3500 u的透析袋中，以30倍體積的純水中靜置24 h(避光透析)，去除多余的VE，得到β－Lg粗提物結(jié)合VE的產(chǎn)物。將透析后的溶液利用真空冷凍干燥機在－45℃冷凍18 h，得到干燥樣品。

1.2.5 單因素實驗 按照1.2.4制備結(jié)合物，以β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例、磁力作用時間、熱激溫度為單因素進行實驗，分別考察這三個因素對β－Lg－VE的結(jié)合率的影響。

1.2.5.1 β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例篩選 于磁力作用時間40 min，熱激溫度80℃，磁力攪拌速度1000 r/min條件下，設(shè)置β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1，研究 β－Lg 粗提物與 VE質(zhì)量比例對VE結(jié)合率的影響。

1.2.5.2 磁力作用時間篩選 于β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例15∶1，熱激溫度 80℃，磁力攪拌速度1000 r/min條件下，設(shè)置磁力作用時間為10、20、30、40、50、60 min，研究磁力作用時間對 VE結(jié)合率的影響。

1.2.5.3 熱激溫度篩選 于β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例為15∶1，磁力作用時間50 min，磁力攪拌速度1000 r/min 條件下，設(shè)置熱激溫度為 35、50、60、70、80、90℃，研究熱激溫度對VE結(jié)合率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面分析法實驗 根據(jù)Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例(A)、磁力作用時間(B)和熱激溫度(C)3個考察因素，每個因素取3水平，分別標記為－1、0、+1，因素與水平編碼見表1。

表1 Box－Behnken實驗設(shè)計因素與水平Table1 Factors and levels of Box－Behnken design

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗均設(shè)3次重復(fù)，將得到的實驗結(jié)果利用Excel、Design－Expert 8.0進行直觀分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VE的標準曲線

由圖1可以看出，在測定范圍內(nèi)，VE濃度和吸光值之間呈良好線性關(guān)系，線性方程為y=1.3863x+0.0158，相關(guān)系數(shù) R2=0.9965。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

圖1 VE標準曲線Fig.1 The standard curve of VE

2.2.1 β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例對VE結(jié)合率的影響 其他條件一定時，考察β－Lg粗提物與VE質(zhì)量比例對結(jié)合效果的影響。從圖可以看出VE的結(jié)合率隨質(zhì)量比例的增加而升高，在15∶1～20∶1時VE的結(jié)合效果較好，對于β－Lg粗提物的質(zhì)量過小，則會導(dǎo)致結(jié)合物表面VE升高，從而造成結(jié)合效果不佳，而β－Lg粗提物的質(zhì)量過大，造成β－Lg粗提物的浪費，因此選擇質(zhì)量比例為15∶1作為較適條件(圖2)。

圖2 質(zhì)量比例對結(jié)合率的影響Fig.2 The quality ratio on combined rate

2.2.2 磁力作用時間對VE結(jié)合率的影響 其他條件一定時，考察磁力作用時間對結(jié)合效果的影響。從圖中可以看出磁力作用時間在10～50 min時VE結(jié)合率隨作用時間的增加而增大，磁力作用時間超過50 min后，作用時間的進一步增加VE的結(jié)合率反而有所下降，是因為磁力作用對蛋白有磁化作用，磁化后蛋白結(jié)構(gòu)有利于結(jié)合VE，但超過50 min后隨著磁力作用時間延長結(jié)合率反而下降，在較高溫度下過長時間磁力作用對蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)造成破壞，使其不利于結(jié)合VE。因此最佳磁力作用時間確定為50 min(圖3)。

2.2.3 熱激溫度對VE結(jié)合率的影響 其他條件一定時，考察熱激溫度對結(jié)合效果的影響。從圖可以看出熱激溫度在35～70℃時VE結(jié)合率隨溫度的上升而增加，熱激溫度超過70℃后，溫度的進一步增加VE的結(jié)合率反而有所下降，可能是因為中性條件下溫度升高時，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有結(jié)合作用的鍵暴露，單體蛋白之間通過這些基團發(fā)生連接聚集，有利于結(jié)合VE;而熱激溫度超過到70℃后，蛋白發(fā)生部分聚合，這種聚合作用隨加熱溫度升高而加劇，不利于結(jié)合 VE。因而最佳熱激溫度為70℃(圖4)。

圖3 磁力作用時間對結(jié)合效果的影響Fig.3 The magnetic role time on combined rate

圖4 熱激溫度對結(jié)合效果的影響Fig.4 The heat－shock temperature on combined rate

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

Box－Benhnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，通過軟件進行多元回歸擬合，得到VE結(jié)合率(Y)對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程如下:

由表3可以看出，模型的p值＜0.0001，說明該模型顯著，失擬項p值為0.4965＞0.05不顯著。該模型的相關(guān)系數(shù)R2為99.1%，調(diào)整后為97.94%，說明該模型能解釋97.94%的響應(yīng)值的變化，證明該模型與實際的擬合性較好。

方差分析可知，磁力作用時間對結(jié)合率影響顯著，質(zhì)量比例和熱激溫度對結(jié)合率的影響極顯著;磁力作用時間與熱激溫度之間交互作用極顯著，其余各因素之間的交互作用均不顯著;磁力作用的二次項對得率的影響顯著，質(zhì)量比例和熱激溫度二次項對得率的影響極顯著。由此可以看出，各因素對得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

各因素的F值表示各因素對響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn)值越大表示該因素對響應(yīng)值的影響越大。從表3可以看出各因素對得率的影響大小排列分別為質(zhì)量比例＞熱激溫度＞磁力作用時間。

由回歸方程得出擬合的磁力作用時間與熱激溫度對結(jié)合率的影響的響應(yīng)面圖見圖5。圖5表示了當質(zhì)量比例為零水平時，磁力作用時間和熱激溫度對VE結(jié)合率影響。響應(yīng)曲面的陡峭程度反映了因素對響應(yīng)值的影響力大小，也表明了因素間交互作用的強弱。由圖5可知，磁力作用時間與熱激溫度之間的交互作用極顯著。

表2 Box－Benhnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The design of theBox－Behnken experiment and its results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 磁力作用時間及熱激溫度對VE結(jié)合率的響應(yīng)面圖Fig.5 Magnetic stirring time and heat－shock temperature on combined rate of response surface

2.4 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證

根據(jù)該模型預(yù)測出理論條件下β－Lg粗提物結(jié)合VE的最佳工藝條件為:質(zhì)量比例19.39∶1，磁力作用時間48.72 min，熱激溫度72.5℃，VE結(jié)合率為68.98%。考慮到實際生產(chǎn)操作，將最優(yōu)工藝條件修正為:質(zhì)量比例19∶1，磁力作用時間49 min，熱激溫度72℃，經(jīng)驗證此條件下 VE的結(jié)合率為(68.5±0.98)%。因此，基于響應(yīng)面法得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，有實用價值。

3 結(jié)論

結(jié)合單因素與響應(yīng)面實驗對β－Lg粗提物結(jié)合VE的工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明質(zhì)量比例、磁力作用時間、熱激溫度三個因素對VE結(jié)合率的影響大小為:質(zhì)量比例＞熱激溫度＞磁力作用時間，最佳工藝條件為質(zhì)量比例19∶1，磁力作用時間49 min，熱激溫度72℃，此條件下VE結(jié)合率高達68.5%。本研究為β－Lg粗提物結(jié)合VE提供了科學(xué)依據(jù)，對VE在食品飲料等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

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