甘露醇凝集素系統及其細胞因子與糖尿病腎病發病的關系

秦建華 張 帆 李 瑩 劉 進 劉 琦 歐三桃 吳蔚樺

(瀘州醫學院附屬醫院腎內科，四川 瀘州 646000)

研究發現，糖尿病患者體內存在甘露聚糖結合凝集素(MBL)水平明顯升高，且與患者的死亡率呈正相關〔1，2〕，因此推測糖尿病腎病(DN)發病可能與MBL途徑補體激活有關。細胞因子通過介導一些急性反應，在DN的發展過程中同樣發揮著重要的作用。細胞因子作為天然免疫的主要組成部分，盡管作用機制都不盡相同，但近年來的研究表明，DN的病程發展與多種細胞因子有關〔3〕。本研究通過比較DN患者血漿MBL及其補體CD59、細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-17和IL-23含量變化，分析DN可能的免疫發病機制，為DN的診斷及治療提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9～12月于我院腎內科就診的80例DN患者為實驗組，均符合DN的早期腎病或臨床腎病診斷標準，男46例，女34例;年齡40～75歲，平均55歲;病程5～20年，平均 15.7年;收縮壓 140～175 mmHg，舒張壓 90～130 mmHg;尿白蛋白排泄量60～400 mg/24 h。按照尿白蛋白排泄率(UAER)分為正常白蛋白尿組(NA，UAER＜30 mg/24 h，n=26)、微量白蛋白尿組(MA，UAER 30～300 mg/24 h，n=33)和臨床蛋白尿組(CA，UAER＞300 mg/24 h，n=21)。選取120例來院體檢的健康老年人為對照組，男62例，女58例，平均年齡(64.96±8.28)歲，收集相應標本的詳細病例資料，病例均無血糖偏高、肝腎功能以及自身免疫疾病等。兩組年齡、性別、病情程度無統計學差異。本研究取得所有受試者的知情同意。

1.2 觀測指標 觀測兩組人群的外周血MBL，肝腎功，血脂，細胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及24 h尿蛋白、尿蛋白排泄率等指標。

1.3 方法 ①標本收集及一般性指標的檢測:測量患者血壓。過夜禁食后次晨空腹肘靜脈采血，測定血清肌酐(SCr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，細胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23。②尿白蛋白測定:留尿當天清晨排空膀胱，棄去尿液，收集至次日晨24 h尿，測定尿總量，混勻后留取部分尿液測定尿蛋白，計算出UAER，全部對象均不連續測定2次，取平均值。③所有患者清晨空腹肘靜脈采血，按試劑盒要求分離血清，保存于－70℃冰箱。收集晨尿標本，用酶聯免疫吸附法測定血清MBL和尿膜攻擊復合物(MAC)。相關細胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23含量的測定采用ELISA法。試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 兩組血清MBL及尿MAC的表達水平分析 血清MBL及尿MAC的表達均與患者的UAER呈正相關性(R2=0.894，0.908;P＜0.05)。CA組SCr、UAER均明顯高于NA組和MA組，MA組SCr、UAER高于NA組。CA組的血清MBL濃度以及尿MAC濃度明顯高于MA組，MA組也高于NA組(均P＜0.05)，見表1，圖1。

2.2 兩組血清細胞因子含量的結果分析 實驗組血漿IL-6含量高于對照組(P＜0.05)，血漿IL-8含量兩組相比無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

表1 實驗組各項指標的檢測結果(±s)

表1 實驗組各項指標的檢測結果(±s)

與NA組比較:1)P＜0.05

組別 n Scr(mmol/L)UAER(mg/24 h)MBL(μg/L)MAC(pg/L)26 80.32±9.87 20.4±6.8 560±110 42±11 MA組 33 98.54±11.231)110.2±25.71)970±3491) 102±401)CA組 21 120.37±29.31)900.3±119.81)1 110±4201)160±301)NA組

圖1 患者UAER與血清MBL及尿MAC的相關性

表2 兩組細胞因子含量的檢測結果(±s，ng/L)

表2 兩組細胞因子含量的檢測結果(±s，ng/L)

與對照組比較:1)P＜0.05

IL-6 IL-8 IL-17 IL-23實驗組 80 547±1091)1 235±3061)270±1101)2 320±8101)組別 n對照組120 430±112 1 290±257 145±49 1 727±879

2.3 兩組單核細胞MBL補體CD59分子檢測 通過流式細胞技術檢測對照組單核細胞CD59陽性的單核細胞比例為23.17%～47.55%，實驗組 CD59陽性的單核細胞比例為64.36%～94.39%，兩組在CD59表達陽性的單核細胞比例上有明顯差異(P＜0.01)。同時，Western檢測結果顯示，實驗組CD59的表達明顯強于對照組，平均為對照組的4.5倍，差異有統計學差異(P＜0.01)，見圖2。

圖2 Western印跡檢測MBL補體CD59的表達

3 討論

DN是糖尿病的重要微血管并發癥，大規模調查研究顯示亞洲人群2型糖尿病患者中DN發生率高，盡管目前加強了血糖管理，但仍有58.6%的糖尿病患者逐漸進展為臨床蛋白尿并出現腎功能受損〔4〕，因此DN的發病機制成為國內外的研究熱點。多項臨床試驗表明，正常蛋白尿組的1型糖尿病患者比非糖尿病組的MBL水平要高，而伴有腎臟病變或已有微量蛋白尿者血清MBL水平則高于正常蛋白尿組。在高MBL基因表達水平和高循環MBL水平的患者，DN更為盛行〔5，6〕。這些證據為科學家們提供了進一步研究DN發病機制的新思路。

MBL為主要由肝細胞和單核細胞分泌的一種血清糖蛋白，是天然免疫防御系統的重要組成部分，是補體激活凝集素途徑的起動因子。MBL在結合病原微生物表面的N氨基半乳糖或甘露糖等糖基配體后按照級聯酶促反應依次裂解補體，最終形成MAC，完成補體激活過程。MBL通過識別微生物表面糖蛋白來激活補體，并受CD59等補體調節蛋白調控，因此一般不會發生自身損傷性MAC的形成〔7〕。但某些情況下也具有潛在的自身活性，例如缺血再灌注后氧化應激可改變細胞表面糖基化狀態而致MBL沉積增加和補體激活〔8〕。高血糖也可引起氧化應激反應，通過非酶糖基化等途徑促使細胞表面糖基化改變，推測正是通過此途徑導致MBL沉積和補體激活，以解釋糖尿病如何受高MBL的影響。

研究發現在1型糖尿病患者中，MBL的基因表達及平均血清濃度明顯高于正常蛋白尿組，甚至同卵雙生患者中，DN組的平均血清MBL濃度也高于正常蛋白尿組〔9〕。動物實驗也發現MBL可以明顯影響糖尿病小鼠的腎臟重量、尿自蛋白排泄量和膠原IVal mRNA的表達，DN大鼠腎臟中存在MBL-A的沉積增加〔10〕。本實驗結果證實在我國2型糖尿病患者體內存在血清MBL濃度升高，經腎臟排出的MAC也明顯增加，患者體內發生了MBL途徑補體激活。另外隨著血清MBL和尿MAC水平的升高，患者尿蛋白逐漸增加，腎臟功能逐漸惡化，MBL濃度與患者腎臟病變的發生和進展密切相關。本研究顯示了MBL獨立于其他因素之外的致病作用。

細胞因子通過介導一些急性反應，在DN的發病過程中發揮著重要作用。IL-6是一種常見的細胞因子，可誘導肝臟合成炎性蛋白質，刺激血管內皮釋放細胞因子，增加血管通透性，導致血管的早期損傷，IL-6過多會使肝臟CRP的合成增加，加重炎性反應〔11〕。姜曉艷等〔12〕認為IL-6與2型糖尿病大血管病變的發生相關，本研究與上述研究結果一致。IL-8是一種可以加強中性粒細胞吞噬功能和殺傷能力的炎性遞質。本研究說明患者存在炎癥反應，這與國內其他研究結果相一致。IL-8含量增高可能是由于2型糖尿病病程進展中對單核細胞、巨噬細胞刺激造成的，反過來產生的炎癥細胞因子又對胰島功能造成損害，加速病程的發展。IL-17是一種有強烈致炎作用的細胞因子〔13〕，多種免疫相關的疾病與IL-17相關。IL-23是一種新發現的細胞因子，近年來與糖尿病的關系也有相關研究發現2型糖尿病患者中IL-23升高，并且并不通過誘導產生干擾素-1來產生胰島素抵抗作用。Abbasi等〔14〕也觀察到在不同類型糖尿病患者中，均存在IL-23升高的情況。本研究提示IL-23在DN病程發展中起著重要作用。

綜上所述，我國DN者體內可能存在血清MBL及細胞因子升高，通過激活凝集素補體途徑及急性反應導致DN發生和進展。高血清MBL及相關細胞因子可以作為糖尿病腎臟損害的預報因子。

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2 Hansen TK，Gall MA，Tarnow L，et al.Mannose-binding lectin and mortality in type 2 diabetes〔J〕.Arch Int Med，2006;166(18):2007.

3 曾曉燕，楊慧英.細胞因子與糖尿病骨質疏松〔J〕.醫學綜述，2012;18(3):424-6.

4 Wu AYT，Kong NCT，De Leon F，et al.An alarmingly high prevalence of diabetic nephropathy in Asian type 2 diabetic patients:the Micro Albuminuria Prevalence(MAP)Study〔J〕.Diabetulogia，2005;48(1):17-26.

5 Hansen Tk TSKST.Elevated levels of mannose-binding lectin in patients with type 1 diabetes〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2003;8(8):4857-61.

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9 Hansen TK，Tarnow L，Thiel S，et al.Association between mannose-binding lectin and vascular complications in Type 1 diabetes〔J〕.Scand J Immun，2004;59(6):613.

10 顏磽勇，黃頌敏，吳 蔚，等.甘露聚格結合凝集索在早期糖展病大鼠腎臟中的表達及意義〔J〕.廣東醫學，2011;32(12):1515-8.

11 Liang H，Block TM，Wang M，et al.Interleukin-6 and oncostatin M are elevated in liver disease in conjunction with candidate hepatocellular carcinoma biomarkerGP73〔J〕.Cancer Biomark，2012;11(4):161-71.

12 姜曉艷，郭 敏，徐 瑩.IL-6與2型糖尿病大血管病變的相關性研究〔J〕.國際免疫學雜志，2007;30(4):210-2.

13 Miossec P.IL-17 and Th17 cells in human inflammatory diseases〔J〕.Microbes Infect，2009;11(5):625-30.

14 Abbasi F，Amiri P，Sayahpour FA，et al.TGF-B and IL-23 gene expression in unstimulated PBMCs of patients with diabetes〔J〕.Endocrine，2012;41(3):430-4.