miR-126在人結腸癌細胞中的表達及其對結腸癌細胞生物學行為的影響

宋軍民 楊 超 常 遠 夏坤錕 王朝杰 (鄭州大學第一附屬醫院肛腸外科，河南 鄭州 450050)

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤〔1〕，但是關于結腸癌遷移與侵襲的機制目前認識尚有限。近來，越來越多的研究支持miRNAs與腫瘤相關〔2，3〕。有研究發現 micro(miR)-126在不同結腸癌細胞株中轉染前后表達水平不同，提示miR-126有可能與結腸癌有一定關系。本文通過穩定表達miR-126的結腸癌細胞系了解miR-126的表達及其對結腸癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年1月在我院腫瘤科確診為結腸癌并且行手術治療的患者80例，每例患者術前均未進行放化療。男46例，女34例，年齡38～55〔平均(47.0±2.5)〕歲;高分化14例，中分化51例，低分化15例;Dukes分期:A期12例，B期22例，C期31例，D期15例;有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移42例。所有組織于離體15 min內置于液氮罐中保存。

1.2 細胞系、載體及試劑 人結腸癌細胞系SW480、人胚腎細胞株(HEK293T)。慢病毒表達載體pGIPZ、慢病毒包裝質粒pCD/NL-BHDDD、慢病毒膜蛋白表達質粒 pLTRG。Lipofectamine2000，快速限制性內切酶 CLai、MLui、T4DNA 連接酶，八肽膽囊收縮術(CCK-8)試劑盒、DMEM培養液、hsa-miR-126原位雜交探針。胎牛血清，總RNA提取液，胰島素受體底物(IRS)-1兔單克隆抗體。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 將SW480結腸癌細胞株在含有10%進口胎牛血清的RPMI1640培養基中37℃、5%CO2飽和濕度貼壁傳代培養，在細胞生長狀態良好時(取對數生長期)用于實驗。

1.3.2 RT-PCR檢測 利用總RNA提取液，嚴格按照提取液操作說明書提取結腸癌組織和癌旁組織中總RNA，cDNA的制備按照 All-in-one miRNA qRT-PCR Detectionkits，反應體系:RNA 2 μg，poly A polymerase(2.5 U/μl，1 μl)，RTase Mix 1 μl，5×反應緩沖液 5 μl，加 H2O至終體積 25 ml。反應條件:37.5℃ 90 min，80℃ 5 min，25℃保存。實施定量PCR的反應體系同樣按照All-in-one miRNA qRT-PCR Detectionkits說明書進行，反應條件:預期變性90℃ 10 min，90℃ 10 s，退火60℃ 30s。

1.3.3 miR-126慢病毒表達載體構建 利用Primes軟件設計引物，同時引入CLai、MLui酶切位點及引物的序列及末端的保護堿基。引物序列正義:5'-CGACGCGTCGGGTTTACAGAACACCCATCA-3'，反義:5'-CCATGGGGCCACAGCAACAAAAGACT-3'，擴增的片段長度為357 bp。以正常黏膜組織基因組DNA為模板，PCR擴增miR-126。PCR成功擴增出包含miR-126前體及側翼序列的DNA片段，將擴增后片段利用2%瓊脂糖進行凝膠電泳直至沒有出現雜質帶，然后對PCR產物純化回收。由CLai、MLui酶切的PCR產物與pGIPZ載體連接，然后再經過轉化，于無菌操作臺中挑選單個克隆放入培養基中并搖菌過夜，對目的片段經PCR鑒定正確的菌液進行質粒提取制備小量質粒，鑒定出的陽性質粒經過DNA測序后得到pGIPZ-miR-126重組質粒。

1.3.4 細胞轉染 嚴格按照Lipofectamine2000試劑說明書操作，采用陽離子脂質體法進行病毒包裝。轉染前24 h，將處于對數生長期的HEK293T接種于6孔培養板中，每孔2×105個細胞。使用含10%進口胎牛血清的高糖型DMEM細胞培養基在37℃、5%CO2條件下培養24 h，待細胞融合度到70%～90%后進行病毒包裝，分為 pGIPZ-miR-126轉染組、空白對照組(pGIPZ)。將兩組病毒上清分別感染SW480細胞，感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察到感染成功的細胞中綠色熒光蛋白(GFP)發綠色熒光，成功轉染細胞后利用流式細胞儀分選GFP陽性的SW480細胞。分選的細胞純度達95%以上，然后置于37℃ 5%CO2的培養箱中培養。

1.3.5 CCK-8檢測結腸癌細胞的增殖能力 在96孔板中按每孔2×103細胞配制100 ml的細胞懸液，每組設3個復孔，在37℃ 5%CO2的條件下將培養板在培養箱預培養24 h;向培養板各加入10 ml轉染組與對照組細胞;將培養板在培養箱孵育一段適當的時間后，向每孔加入10 ml CCK-8溶液，將培養板在培養箱內繼續孵育2 h;取細胞轉染后12 h、24 h、48 h三個時間點進行CCK-8檢測，使用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其吸光度，重復3次。

1.3.6 劃痕實驗觀察細胞遷移能力 將兩組細胞分別接種于6孔板，放入37℃ 5%CO2培養箱中孵育。待長至臨近飽和時，用10 μl微量移液頭消毒后在細胞板上垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。倒置顯微鏡下每隔24 h觀察各組細胞的遷移情況并拍照。

1.3.7 Transwell實驗觀察細胞侵襲能力 小室接種細胞前2 h將基質膠Matrigel用無血清的RPMI1640培養基稀釋成濃度為1∶5，每個小室加50 μl，放入37℃ 5%CO2培養箱中孵育2 h;接種200 μl無血清培養基細胞(5×105/ml)，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液。37℃ 5%CO2條件下培養24～48 h后，取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定下室面，結晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗滌。顯微鏡下隨機選取4個高倍視野計數穿過膜的細胞數，并計算平均值。實驗重復3次。

1.4 統計學方法 利用SPSS16.0軟件進行χ2及t檢驗。

2 結果

2.1 熒光定量PCR檢測miR-126在結腸癌組織中表達 結腸癌組織中miR-126表達陽性率顯著低于癌旁正常黏膜組織(P＜0.05)。見表1。并且，miR-126的表達與年齡、性別及分化程度無明顯相關性(P＞0.05)，與結腸癌臨床分期、有無淋巴結轉移顯著相關(P＜0.05)。見表2。

表1 miR-126在結腸癌和癌旁正常黏膜中的表達〔n(%)〕

表2 miR-126表達與結腸癌患者臨床特征的相關性分析(n)

2.2 miR-126表達對結腸癌細胞生物學行為的影響

2.2.1 miR-126表達對SW480細胞生長的影響 隨培養時間的延長，轉染組細胞增殖能力明顯低于空白對照組。見表3。

表3 miR-126對SW480細胞增殖的影響〔±s，n=3，L/(g·cm)〕

表3 miR-126對SW480細胞增殖的影響〔±s，n=3，L/(g·cm)〕

12 h 24 h 48 h對照組組別0.325±0.010 0.449±0.012 0.738±0.017轉染組 0.265±0.008 0.335±0.007 0.366±0.012 t/P值8.115/0.001 14.213/0.000 23.517/0.000

2.2.2 miR-126表達對SW480細胞遷移能力的影響 對SW480兩組細胞劃痕處理后，間隔24 h連續觀察細胞的遷移情況，可見空白對照組劃痕72 h后，細胞已基本完全覆蓋劃痕區域，而轉染組則未完全覆蓋。表明miR-126具有抑制結腸癌細胞遷移的能力。

2.2.3 miR-126表達對SW480細胞侵襲能力的影響 鋪有基質膠的細胞培養36 h后，轉染組及空白對照組細胞遷移至下室的細胞個數分別為(10±4.81)個和(262±31.26)個;無基質膠的細胞在培養36 h后計數遷移至下室的細胞數目，轉染組和空白對照組分別為(81±14.27)個和(341±24.23)個，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

結腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命和健康，發生侵襲轉移為其主要死因。MicroRNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控，導致靶基因在 mRNA水平降解或引起蛋白翻譯抑制〔4～6〕。miRNAs在細胞增殖、遷移、侵襲、基因調控及腫瘤的轉移等多種生物過程中起著十分重要的作用〔7，8〕。在分析這些miRNA分子的生物學功能時，發現miR-126與多種腫瘤的發生發展密切相關，并有研究報道其在結腸癌組織中表達下調〔9〕。前期研究發現，miR-126具有抑制結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的能力，可見在結腸癌發生侵襲轉移的過程中miR-126發揮舉足輕重的作用〔10，11〕。本實驗結果說明miR-126可以明顯抑制細胞增殖，發揮抑制腫瘤生長的作用。同時，miR-126可抑制結腸癌細胞遷移能力及侵襲能力，發揮抑制結腸癌侵襲轉移的功能。綜上所述，在結腸癌中存在miR-126表達下調，其下調與結腸癌是否發生侵襲轉移密切相關。體外實驗也證實miR-126可通過抑制結腸癌細胞增殖、轉移與侵襲而發揮抑瘤作用，為結腸癌轉移抑制性miRNA。

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8 Pichler M，Winter E，Stotz M，et al.Down-regulation of KRAs-in-teracting miRNA-143 predicts poor prognosis but not response to EGFR-targeted agents in colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer，2012;106(11):1826-32.

9 李 楠，李夏雨，黃 鑠，等.miR-126靶向調控IRSI，SLC7A5及TOMI基因抑制結腸癌的增殖及侵襲轉移〔J〕.中南大學學報(醫學版)，2013;38(8):809-17.

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