瑞舒伐他汀對冠心病患者內皮功能的影響

潘力健 劉 磊 尚文靜 龔 輝 (復旦大學附屬金山醫院心血管內科，上海 201508)

血管內皮作為機體最大的內分泌腺，可通過多種機制在凝血和動脈粥樣硬化斑塊形成過程中起重要作用。已有研究表明，內皮功能失調是動脈粥樣硬化形成和發展的始動因素之一，存在于冠心病的發生、發展中，甚至存在于冠心病發病之前〔1〕，因此，深入了解內皮功能紊亂與冠心病之間的關系具有重要價值。瑞舒伐他汀可通過影響一氧化氮(NO)合酶(NOS)的活性，影響血管舒張因子內皮源性NO釋放，來調節血管內皮功能〔2〕。而非對稱二甲基精氨酸(ADMA)及其特異性水解酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)是體內維持NOS/NO水平平衡的重要因素，本文擬分析瑞舒伐他汀是否通過DDAH/ADMA通路影響NOS/NO水平，從而來改善血管內皮功能，進而起到治療冠心病的作用。

1 對象與方法

1.1 一般資料 2013年6月至2014年6月我院在門診體檢的健康志愿者15例，冠心病患者30例。納入標準:①患者均符合2006年AHA/ACC冠心病和其他動脈粥樣硬化性血管疾病二級預防指南中的診斷標準，其中冠脈造影冠狀動脈狹窄大于50%;②無嚴重的心肝腎等臟器疾病;③患者無糖尿病，并且體質指數(BMI)＜30 kg/m2，低密度脂蛋白(LDL)＜2.6 mmol/L。排除標準:①有活動性肝病或肝功能異常、充血性心力衰竭、腎功能不全或出血傾向及過敏體質者;②既往患有結核病，既往服用他汀類藥物治療，存在多種疾病并長期服用多種多類(＞2種;＞2類)藥物者。本研究符合本單位倫理學標準并得到批準，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.2 分組方法 冠心病患者隨機分為常規治療組和瑞舒伐他汀組，每組15例，常規治療組采取不包含瑞舒伐他汀的常規治療，瑞舒伐他汀組在常規治療組的基礎上運用小劑量瑞舒伐他汀5 mg口服。4 w后抽取3組靜脈血進行后續試驗。

1.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 取各組上清，采用ELISA檢查各組血清ADMA、NOS和NO的表達水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4 外周血循環血管內皮祖細胞(EPCs)分離及培養 取各組新鮮抗凝血液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)等倍稀釋，將稀釋血液緩慢加于2倍的淋巴細胞分層液上，水平離心，取細胞層重懸于PBS，洗滌離心后收集細胞于含有血管內皮細胞生長因子、堿性纖維母細胞生長因子、類胰島素樣生長因子、表皮細胞生長因子和5%胎牛血清的EBM-2培養液中，置37℃5%CO2孵箱賠養。72 h后棄掉懸浮細胞，貼壁細胞繼續給予完全培養基培養，隔天換液，第7天時收集細胞備用〔3〕。

1.5 流式細胞術檢測EPCs免疫表型 收集第7天細胞，流式洗液洗滌，計數，調整細胞濃度為1×106/ml置于流式管中。加入熒光標記的CD146抗體，混勻后4℃標記30 min，洗去未結合的抗體后加入300 μl預冷的洗液重懸于流式管中，流式細胞儀檢測，相關軟件分析。

1.6 DDAH活性檢測 收集第7天細胞，細胞裂解液裂解后取上清，應用分光光度法檢測 L-胍氨酸(L-cit)濃度來反映DDAH活性。設定健康對照組的DDAH活性為100%，其他組DDAH活性以與健康對照組的比值來表示。

1.7 DDAH mRNA測定 委托Takala公司進行DDAH引物的設計，收集第7天細胞，采用Trizol一步法提取總RNA，cDNA的制備，將提出的總RNA進行mRNA純化，在運用純化的mR-NA進行反轉錄，用反轉錄的cDNA進行熒光定量PCR，建立標準曲線，對DDAH mRNA表達進行定量分析。

1.8 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 各組血清ADMA、NOS和NO濃度變化 血清NO含量，常規治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規治療組(P＜0.05);血清NOS含量，常規治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規治療組(P＜0.05);血清ADMA含量，常規治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯高于健康對照組，瑞舒伐他汀組含量明顯低于常規治療組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

與健康對照組相比:1)P＜0.05;與常規治療組相比:2)P＜0.05

組別 NO(μmol/L) NOS(μmol/L) ADMA(ng/ml)95.23±5.62 34.95±5.23 180.65±6.99常規治療組 69.21±6.011) 10.97±4.961) 260.78±6.261)瑞舒伐他汀組 76.91±5.491)2) 16.55±5.341)2)231.53±4.521)2)健康對照組

2.2 各組EPCs中CD146表達比例變化 常規治療組〔(60.59±4.63)%〕及瑞舒伐他汀組EPCs中CD146表達比例〔(68.22±5.11)%〕均明顯低于健康對照組〔(75.65±5.96)%〕，瑞舒伐他汀組比例明顯高于常規治療組(P＜0.05)。

2.3 各組EPCs中DDAH活性變化 健康對照組的DDAH活性為100%，常規治療組(49.24%±5.65%)及瑞舒伐他汀組DDAH活性(62.13%±3.48%)均明顯低于健康對照組，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規治療組(P＜0.05)。

2.4 各組EPCs中DDAH mRNA表達變化 常規治療組(0.60±2.34)及瑞舒伐他汀組 DDAH mRNA相對表達量(0.71±3.82)均明顯低于健康對照組(1.00)，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規治療組(P＜0.05)。

3 討論

血管內皮是體內重要屏障，通過多種機制參與動脈粥樣硬化斑塊形成過程。研究證實，內皮功能紊亂與冠心病的發生發展密切相關，其機制可能與以下相關:①內皮功能紊亂可導致生成的NO含量減少，對LDL氧化修飾的抑制度降低，LDL生成增加，從而促進了血管內膜脂質的沉積〔4〕;②NO可與體內相關物質結合提高組織型纖溶酶原激活劑的活性，并且可抑制血小板聚集，影響血管內炎性因子的分泌和調節，破壞血管內皮影響血管功能〔5〕;③NO含量減少，導致內皮素-1分泌增加，促進了細胞的增殖和血管調節，導致了血管的損傷，從而促進了冠心病的產生;④內皮功能紊亂可導致氧自由基生成增多，使血管擴張受抑制，使其抗血栓、抗黏附等能力降低，有利于冠心病的發生;⑤內皮細胞受損，黏附因子表達增加，促進了細胞間的黏附結合，使形成脂質斑塊的能力增強〔6〕。NO在體內是以L-精氨酸為底物，經NOS催化而生成，體內的ADMA為內源性NOS抑制物，可抑制NO的合成，導致內皮功能紊亂。DDAH是ADMA的特異性水解酶，位于內皮樣細胞中，它在調節組織和細胞內ADMA水平中起關鍵作用，多數研究人員認為，DDAH/ADMA通路與NO的生成、分泌、降解等密切相關〔7〕。

瑞舒伐他汀在臨床上的推廣多得益于調節血脂水平(尤其是LDL)來穩定和逆轉動脈粥樣硬化斑塊，從而改善糖尿病患者的臨床癥狀。不過近來發現，其具有獨立于調脂治療以外的多效性作用，如:抗炎作用，改善內皮細胞的作用，抑制平滑肌細胞增殖，抑制血栓形成的作用，抑制腫瘤細胞的增殖、誘導分化或凋亡等作用，其中改善血管內皮功能的作用倍受關注〔8〕。瑞舒伐他汀對血管內皮功能影響的可能機制有:①增加NO的釋放和利用度，降低LDL生成，從而減少了脂質的沉積;②增加LDL氧化阻力;③抑制炎性反應;④促進斑塊穩定等〔9，10〕，但其具體機制仍未明確。

本研究提示了瑞舒伐他汀可能通過影響NO/NOS通路來發揮藥理作用。CD146是目前公認的EPCs特異標記分子，瑞舒伐他汀可通過調整EPCs來起到治療作用。瑞舒伐他汀可能通過影響DDAH/ADMA通路來影響內皮功能，從而達到治療作用。然而，瑞舒伐他汀通過何種機制影響DDAH/ADMA通路，并且阻斷DDAH/ADMA通路是否可以阻斷瑞舒伐他汀的治療作用，還需要深入研究。

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2 陳 懿，徐世鄂.瑞舒伐他汀和阿托伐他汀對冠心病患者的調脂作用和安全性比較〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(9):2389-90.

3 苗巧巧，陳 慧.血管內皮祖細胞與腦血管性疾病〔J〕.醫學綜述，2012;18(16):2542-4.

4 王 鋒.2型糖尿病合并冠心病患者血清C反應蛋白和血清血管細胞黏附分子-1表達及瑞舒伐他汀鈣的干預作用〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(4):913-4.

5 李 陽，曾高峰.非對稱性二甲基精氨酸、內皮祖細胞與冠心病關系的研究進展〔J〕.中國循證心血管醫學雜志，2013;13(6):674-5.

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7 王中群，楊永宗，嚴金川，等.免疫應答與動脈粥樣硬化〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013;15(11):1216-7.

8 韓健雄，王小扁，胡澤平，等.瑞舒伐他汀對實驗性動脈粥樣硬化兔動脈平滑肌細胞骨橋蛋白表達的影響〔J〕.安徽醫科大學學報，2012;47(2):126-9.

9 馮雪茹，張婧薇，劉梅林，等.瑞舒伐他汀對中國頸動脈粥樣硬化患者內中膜厚度和安全性的薈萃分析〔J〕.中華心血管病雜志，2014;42(3):247-53.

10 杜瑞雪，葉 平，顏光濤，等.瑞舒伐他汀強化治療對外周動脈粥樣硬化患者粘附分子的影響及上游機制〔J〕.南方醫科大學學報，2012;32(11):1610-4.