老年晚期結直腸癌患者腫瘤組織胸苷酸合成酶表達與氟尿嘧啶敏感性、副反應及預后的關系

馮 莉 王貴英 (河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北 石家莊 0500)

結直腸癌好發于中老年人群，近年發病率及病死率呈上升趨勢〔1〕。以手術為主，化療、放療為輔的綜合治療方案是目前結直腸癌有效的治療方法，而氟尿嘧啶(5-Fu)為結直腸癌患者化療重要藥物，因此患者對于5-Fu敏感性可影響其預后〔2〕。化療在殺滅正常癌細胞的同時會損傷正常細胞組織，導致患者出現各種副反應。老年結直腸癌患者由于機體功能衰退，對化療耐受性較差，從而影響其治療效果。因此化療前正常評估患者對化療方案的敏感性及對毒副反應的耐受性將有助于促進患者預后。胸苷酸合成酶(TS)是增殖期細胞所必需蛋白質，是DNA合成反應中的重要酶類〔3〕。近年研究指出〔4〕，TS表達水平與腫瘤的發生、進展及化療敏感性有密切關系。本研究探討老年結直腸癌患者腫瘤組織中TS陽性表達情況及其與5-Fu敏感性、副反應及預后的關系。

1 資料及方法

1.1 一般資料 2012年6月至2014年6月78例確診為結直腸癌老年患者，納入標準:①經病理組織學確診為結直腸癌;②參照美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期(第7版)為Ⅲ～Ⅳ期;③卡氏(KPS)評分≥70分;④術前經腹部CT或B超檢查排除遠處轉移;⑤術后均應用5-Fu為主的化療方案。排除標準:合并惡性腫瘤史或臨床資料不全患者。其中男45例，女33例;年齡62～75歲，平均(66.3±3.8)歲。病理類型:高分化 24例，中分化24例，低分化30例。臨床分期:Ⅲ期38例，Ⅳ期40例。浸潤程度:T1 19例，T2 12例，T3 30例，T4 17例。

1.2 免疫組化法

1.2.1 主要試劑 內源性過氧化物酶(北京康為世紀生物科技有限公司);TS單克隆抗體(即用型，購于北京中衫金橋公司);辣根過氧化物酶(上海朗瑞精細化學品有限公司)。

1.2.2 步驟 調取本院病理科中保存完整的標本蠟塊，重新切片采用SP法進行免疫組化染色。具體操作如下:將標本蠟塊切成4 μm厚切片，于室溫下采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。應用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，以0.01 mol/L PBS沖洗2次。采用正常羊血清工作液封閉樣本10 min，加入鼠抗人TS單克隆抗體，并采用PBS沖洗2次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素工作液，于37℃下孵育25 min，采用PBS液沖洗2次，經DAB染色，蘇木素復染，采用中性樹膠封固。

1.2.3 結果判斷 根據病理切片染色面積及深度對結果進行評分。染色深度評分:0分顯色不清或不顯色;1分土黃色;2分棕黃色;3分褐黃色。染色面積:0分0%且≤5%，1分為＞5%且≤35%，2分＞35%～65%;3分＞65%。染色深度與面積相加/2則為平均分，其中1分(+)為0.5～1;2分()為1.5～2.0;3分()為2.5～3.0。

1.3 4、5-二甲基噻唑-2(MTT)法檢測敏感性

1.3.1 主要試劑 0.9%氯化鈉溶液(廣州百特醫療用品有限公司);0.25%胰蛋白酶消化液(北京紐因華信科技發展有限公司);苔盼藍(北京中生瑞泰科技有限公司)。

1.3.2 實驗步驟及結果判斷 取腫瘤組織約1 g，采用0.9%氯化鈉溶液漂洗2次，剪碎腫瘤，加入0.25%胰蛋白酶消化液，經200目濾篩過濾，并制成單細胞懸浮液。采用苔盼藍染色計算活細胞，并采用完全培養液將細胞濃度調整為5×105/ml，并將細胞接種于96孔板中，每孔100 μl。將孔板分為實驗組、對照組、空白組，實驗組中加入5-Fu，20 μl/孔，對照組加入等量培養液，空白組不加入細胞懸浮液，只加入PBS。將培養板置于37℃、5%CO2環境中培養48 h，并于每個培養孔中加入20 μl MTT，繼續培養4 h，棄去上清液，并加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)，輕輕震蕩充分搖勻，并采用酶標儀測定各孔光密度(OD)值，并計算抑制率(CI)。當CI≥30%為敏感，CI＜30%為不敏感。

1.4 療效評價 ①近期療效:根據實體瘤療效評價標準(RECIST標準)進行療效評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩定(SD)、疾病進展(PD)。其中CR+PR為總有效率(RR)。②化療毒副反應:參照世界衛生組織(WHO)抗癌藥物急性及亞急性毒性分級0～Ⅳ度。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 TS在結直腸癌中的表達情況 結直腸癌組織中TS陽性表達率〔74.36%(58/78)〕顯著高于正常癌旁組織〔10.26%(8/78)〕(χ2=7.852，P=0.002)。

2.2 TS陽性表達與臨床病理特征的關系 TS表達與結直腸癌患者淋巴結轉移、陽性淋巴結數、分化程度、浸潤程度有關(P＜0.01)，而與性別、年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、TNM分期無關(P ＞0.05)，見表1。

表1 TS陽性表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3 TS陽性表達與不良反應的關系 TS陽性表達患者惡心嘔吐、骨髓抑制、腹瀉、口腔黏膜炎化療毒副反應等級顯著高于TS陰性患者(P＜0.01)，見表2。

表2 TS陽性表達與不良反應的關系(n)

2.4 TS陽性表達與近期化療效果及敏感率的關系 患者均順利完成化療，TS陽性表達患者化療總有效率、化療敏感率顯著高于TS陰性患者(P＜0.05)，見表3。

表3 TS陽性表達與近期化療效果及敏感率的關系〔n(%)〕

3 討論

TS是胸苷酸合成限速酶，通過抑制TS生成能有效抑制DNA的生物合成，從而抑制細胞生長及增殖〔5〕。5-Fu可通過抑制TS生成而發揮抗癌活性，TS被認為是5-Fu及其衍生物殺滅癌細胞的靶點〔6〕。本研究提示TS表達水平升高與結直腸癌的發生具有密切關系。Negri等〔7〕檢測了接受5-Fu化療后發生轉移的大腸癌患者TS表達水平，結果發現TS水平與生存期呈負相關(P＜0.05)。本研究進一步論證了TS表達水平可作為臨床結直腸癌患者化療藥物選擇的評價指標。

盡管5-Fu是結直腸癌化療中首選的藥物，但由于個體差異，并不是所有患者都對5-Fu敏感，不同個體間存在顯著差異，甚至個別病例可發生血液學毒性及致死性消化道不良反應〔8〕。張婷婷等〔9〕應用DNA芯片對5-Fu耐藥的癌細胞株進行分析發現TS過度表達。任建林等〔10〕對5-Fu類藥物作用機制進行研究時發現，TP不僅是5-Fu及其前體藥物的催化酶，同時還具有促進腫瘤血管生成的作用，TS在腫瘤組織侵犯轉移過程中起到重要的作用。本研究提示TS過度表達可影響5-Fu類藥物化療敏感率，從而影響患者治療效果。這可能與如下因素有關:①TS高表達可促進腫瘤細胞內DNA合成，從而加速腫瘤細胞增殖，加速患者病情進展。②TS作為5-Fu類藥物的關鍵靶點，其表達水平增高，表明該靶點對化療的敏感性下降，產生了耐藥性，因此化療效果較差。

本研究結果與何瓊等〔11〕及Avallone等〔12〕研究結果一致，研究結果均表明T分期或M分期越高的患者的患者，TS mRNA的表達水平越高。由于TS與血小板內皮細胞生長因子屬于同一類物質，具有促進血管內皮細胞區劃移動來刺激血管生成的作用。TS表達水平增加表面血管生長及侵襲性更強，患者惡性程度更高，因此通過測定腫瘤TS中的表達水平可有效預測結直腸癌患者病情進展及惡性情況。5-Fu在體內可被二氫尿嘧啶脫氫酶(DPD)轉化生成5-氟二氫尿嘧啶排出體外，而TS可抑制DPD表達水平，當TS活性及表達水平增加時可影響DPD合成，降低DPD活性，使得血漿中5-Fu不能及時排出體外，導致5-Fu在血漿中大量蓄積，從而引起患者出現胃腸道及血液毒性，增加患者毒副反應〔13〕。本研究表明TS表達水平與5-Fu毒副反應有密切的關系。可根據TS與5-Fu化療敏感性及毒副反應情況，在毒副反應中應篩選出TS陽性表達患者，并調整5-Fu化療方案及劑量，從而提高患者化療效果。

綜上，TS高表達水平與直腸癌發生及病情進展具有密切的關系。直腸癌組織中TS表達可作為患者化療敏感性、化療副反應及預后的評價指標。

1 馮 莉，韓 晶，左 靜，等.結直腸癌胸苷酸合成酶表達與氟尿嘧啶敏感性和臨床病理特征及預后的相關性研究〔J〕.中國全科醫學，2014;17(6):666-70.

2 唐 健，莊燕妍，程文捷，等.胃腸道惡性腫瘤中胸苷酸合成酶基因多態性與5-FU化療敏感性的Meta分析〔J〕.中國現代醫學雜志，2012;22(8):58-62.

3 Shigeta K，Ishii Y，Hasegawa H，et al.Evaluation of 5-fluorouracil metabolic enzymes as predictors of response to adjuvant chemotherapy outcomes in patients with Stage Ⅱ/Ⅲ colorectal cancer:a decision-curve analysis〔J〕.World J Surg，2014;29(5):78.

4 Baroudi O，Baroudi T，Omrane I，et al.Thymidylate synthase polymorphism in sporadic colorectal and gastric cancer in Tunisian population:a predictive role in 5-fluorouracil based chemotherapy treatment〔J〕.Med Oncol，2014;31(2):825-6.

5 周守兵，蔣 華，李文娟，等.胸苷酸合成酶、胸苷酸磷酸化酶的表達與培美曲塞時辰化療的療效分析〔J〕.腫瘤防治研究，2012;39(10):1202-6.

6 Sulzyc-Bielicka V，Domagala P，Bielicki D，et al.Thymidylate synthase expression and p21(WAF1)/p53 phenotype of colon cancers identify patients who may benefit from 5-fluorouracil based therapy〔J〕.Cell Oncol(Dordr)，2014;37(1):17-28.

7 Negri FV，Azzoni C，Bottarelli L，et al.Thymidylate synthase，topoisomerase-1 and microsatellite instability:relationship with outcome in mucinous colorectal cancer treated with fluorouracil〔J〕.Anticancer Res，2013;33(10):4611-7.

8 陳英華，傅建偉，鄧 媛，等.晚期胃癌患者外周血中TS和DPD mRNA的表達對替吉奧化療療效的影響〔J〕.重慶醫學，2013;42(12):1357-9.

9 張婷婷，于 壯，崔蓮花，等.胸苷酸合成酶基因多態性與晚期非小細胞肺癌化療敏感性的關系〔J〕.山東醫藥，2011;51(21):1-3.

10 任建林，田 林，趙素琴，等.胸苷酸合成酶、胸苷磷酸化酶和dUTPase在大腸癌組織中的表達及其臨床病理學意義〔J〕.中國醫師進修雜志，2012;35(1):50-3.

11 何 瓊，高 靜，王婷婷，等.晚期胃癌患者血清TS、TP表達水平與氟尿嘧啶為基礎的化療療效及預后的相關性〔J〕.中國癌癥雜志，2013;5(4):292-7.

12 Avallone A，Di Gennaro E，Silvestro L，et al.Targeting thymidylate synthase in colorectal cancer:critical re-evaluation and emerging therapeutic role of raltitrexed〔J〕.Expert Opin Drug Saf，2014;13(1):113-29.

13 Sulzyc-Bielicka V，Bielicki D，Binczak-Kuleta A，et al.Thymidylate synthase gene polymorphism and survival of colorectal cancer patients receiving adjuvant 5-fluorouracil〔J〕.Genet Test Mol Biomarkers，2013;17(11):799-806.